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【摘要】 目的 建立火腿肠食品中苯甲酸、山梨酸的高效液相色谱测定方法。 方法 样品加入海砂分散黏稠成块的样品，在碱性条件下用水振荡提取，加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质、淀粉和脂肪等，滤膜过滤进行液相色谱分析。 结果 方法回收率90.9%～95.1%,RSD﹤5%，浓度在0.01～0.20mg/ml范围内呈良好的线性关系(r＞0.9994),检出限苯甲酸、山梨酸均为2mg/kg。 结论 建立的方法处理样品操作简便，灵敏度、准确度均符合实验要求。
【关键词】 火腿肠 苯甲酸 山梨酸 高效液相色谱法
Methodological study on the determination of sorbic acid and benzoic acid in ham by HPLC.
DONG Chang-bo.
(Jining Municipal Center for Disease Control and Prevention, Jining 272000, Shandong, P. R. China)
Abstract：Objective To establish a method for determination of sorbic acid and benzoic acid in ham by HPLC. Methods Sea sand were added into samples (to distract the chunk)-distill by water in the condition of alkalescence vibratedly-add potassium ferrocyanide and zinc acetate (to deposit protein, faecula,fat.)-determination by HPLC after filtration. Results The recovery rate was between 90.9% and 95.1%,RSD<5%.The linear relation of concentration was significant in 0.01～0.20mg/kg. Conclusion The method is simple,accurate and highly sensitive.
Key words：Ham; Sorbic acid; Benzoic acid; HPLC
火腿肠是深受广大消费者欢迎的肉类食品，我国已出台并在2007年6月1日实施《火腿肠》国家标准（GB/T 2012-2006），标准规定了根据原料不同又有“鸡肉肠”、“鱼肉肠”、“牛肉肠”等品种。为防止食品变质，生产厂家常在火腿肠中加入防腐剂。我国目前常用食品防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐为主。防腐剂可以抑制和杀灭微生物，但过量和超范围使用会破坏食品中维生素、加重人体肝脏负担并引起毒性反应。国标GB2760-1996《食品添加剂使用卫生标准》中规定火腿肠类肉制品食品中苯甲酸不得检出，山梨酸及其钾盐（以山梨酸计）不得超过0.075g/kg。在日常检测工作中仍可在火腿肠样品中检出苯甲酸和超标加入的山梨酸。
火腿肠中苯甲酸和山梨酸的测定样品处理方法，在国标GB/T5009.29-2003中苯甲酸、山梨酸测定的液相色谱法中，只规定了饮料和配制酒样品处理方法，其它样品处理没有提及。火腿肠食品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基质成份较多，并且苯甲酸、山梨酸具有脂溶性的性质决定了样品处理的复杂性。本文针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品处理方法进行了改进和研究，建立了有效的高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的样品处理方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 SP8810液相色谱仪、紫外检测器；ODS-C18反相色谱柱；HY－4多用样品振荡器；0.45μm微孔滤膜；甲醇（色谱纯）；0.02mol/L乙酸铵溶液；20目海砂；10g/L氢氧化钠溶液；100g/L亚铁氰化钾溶液；200g/L乙酸锌溶液；苯甲酸、山梨酸标准液。
1.2 液相色谱条件 流动相：甲醇＋0.02mol/L乙酸铵溶液＝5＋95；流速：1.0ml/min；柱温：室温；紫外检测波长：230nm。
1.3 样品处理与测定 将火腿肠样品用组织捣碎机均质后，称取5.0g于具塞三角瓶中，加入2～5g 20目海砂，搅拌均匀，加入50.0ml水、1.0ml氢氧化钠溶液，盖塞放于样品振荡器上振荡提取1h，加入9.5ml亚铁氰化钾溶液、9.5ml乙酸锌溶液，振摇使其充分混匀后，静置1～2h使其沉淀（也可用离心机以3 000转／min，离心10min）。用滤纸初滤去除脂肪和沉淀物，收集初滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液10μl进行HPLC测定。
2 结果
2.1 样品提取条件的选择 在碱性条件下，苯甲酸与山梨酸形成相应的盐类而易溶于水，故加入氢氧化钠溶液使之形成可溶于水的盐。用水提取样品中苯甲酸、山梨酸可选用超声波法、振荡法、直接浸泡法。火腿肠样品在用组织捣碎机均质后，非常黏稠并易结成块状，不能与提取液充分接触，而造成提取效率低。故在样品中加入海砂，以分散黏稠的样品，使与提取液充分接触。在样品加入提取液后分别用超声波提取30min、振荡提取1h、直接浸泡过夜（24h）然后过滤，取滤液进行HPLC测定，对这三种样品提取方法的结果进行了比较。从实验结果分析，直接浸泡和超声波提取方法结果回收率低，不能满足检测方法的要求，只有振荡法回收率达到方法要求。原因是振荡器提取是通过不断振荡，海砂不断冲击分散黏稠成块的样品，使样品与提取液充分接触混匀，从而提取完全，结果回收率高，故选用振荡提取方式用于本方法的检测。
2.2 蛋白质和淀粉对分析方法干扰与消除 火腿肠样品中含有丰富的蛋白质和部分淀粉，样品在浸泡提取过程中，会含有大量的水溶性蛋白质和淀粉，如果净化不完全，直接过膜进行HPLC分析，将堵塞色谱柱，严重影响色谱柱的使用寿命。因此火腿肠样品处理的关键是找到一种理想的沉淀剂，尽量排除样品中的油脂、蛋白质、淀粉等，并且不影响待测组分的回收率。常用食品蛋白沉淀剂有100g/L硫酸铜溶液、100g/L钨酸钠溶液、100g/L亚铁氰化钾与200g/L乙酸锌溶液。硫酸铜溶液对于蛋白质含量低的样品尚可，而对于火腿肠食品则不理想，经实验发现初滤液混浊不能通过滤膜。钨酸钠溶液沉淀效果好些，经实验发现初滤液仍有堵塞滤膜的现象。亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为沉淀剂通过实验发现效果最好，不仅可沉淀蛋白质，还可使淀粉变性沉淀，基本可使提取液澄清，初滤液可顺利通过滤膜，故选用亚铁氰化钾与乙酸锌作为沉淀剂。
2.3 脂肪对分析方法的干扰与消除 提取液所含的脂肪在振荡时可成球状悬浮在上层，并且在加入蛋白沉淀剂后，还可减少脂肪的乳化作用使脂肪与提取液充分分离。对于脂肪含量很高的样品，可将样品提取液置于沸水浴中15min使脂肪充分熔化，取出冷至室温后，放于﹣1℃冰箱中进行冷冻处理，大多数脂肪在冰点处析出，样品提取液中基本不含脂肪［1］，从而消除脂肪对实验方法的干扰。
2.4 标准曲线的制备 分别配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg/ml浓度的苯甲酸、山梨酸标准溶液进行分析，根据峰面积和浓度关系绘制标准曲线，得到苯甲酸、山梨酸的回归方程。苯甲酸回归方程：Y＝2.865×106X＋2131，r＝0.9996；山梨酸回归方程：Y＝2.269×106X＋2250，r＝0.9994。标准系列浓度在0.01～0.20mg/ml范围内呈良好的线性关系。苯甲酸、山梨酸检出限（S/N＝3）均为2.0mg/kg。
2.5 方法精密度和回收率实验结果 取已测定含量的火腿肠样品，分别添加高、中、低三种不同浓度的苯甲酸、山梨酸标准液，按本方法进行提取，各进行6次测定，结果见表1。
表1 火腿肠食品中苯甲酸、山梨酸含量精密度及回收率检测结果（略）
由表1检测结果，方法回收率在90.9%～95.1%之间，变异系数在1.26%～3.25%之间，符合国家对检测方法的要求。
3 讨论
采用本方法处理火腿肠样品，可有效改变火腿肠样品在均质后黏稠成块的现象，使样品均匀分散在提取液中，达到提高结果回收率的目的。在碱性条件下加入亚铁氰化钾和乙酸锌可有效沉淀分离样品中含有的蛋白质、脂肪、淀粉等基质，沉淀剂不干扰苯甲酸、山梨酸测定，样品滤液无悬浮物质起到保护色谱柱，延长色谱柱使用寿命作用。本方法回收率在90.9%～95.1%之间，RSD在1.26%～3.25%之间，标准系列浓度在0.01～0.20mg/ml范围内呈良好的线性关系，完全满足方法分析的要求，适宜在日常检测工作中应用。
【参考文献】
［1］ 王阿利，张晓东，潘月亮，等．低温聚凝盐重解析分析海产品中亚铁氰化钾方法研究［J］．预防医学论坛，2005,11(5):566．
作者单位：济宁市疾病预防控制中心，山东 济宁 272000.