云南巴尔通体的系统发育多样性分析

【摘要】  　　目的 基于gltA基因序列的系统发育分析对云南巴尔通体的多样性进行分析。 方法 用云南省1999年至今分离到的并已在GenBank中公布的32个巴尔通体变异体（gltA基因）为目标株，利用网上核酸序列比对程序BLAST进行核酸序列同源性搜索,调出相似性最高且有效发表种典型菌株为对比株，进行比对和系统发育分析。 结果 32个巴尔通体变异体可归为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis和B.yunnannensis 7个分枝。同一枝中所有分离的变异体与其发育关系最密切且有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列均有不同程度的差异。部分变异体与有效发表种典型的菌株间存在较大的遗传差异。 结论 云南巴尔通体菌不仅具系统发育多样性，而且还具有其特异性和可能有潜在的新种。一些不明原因的疾病有可能与巴尔通体的感染有关不容忽视。

【关键词】  云南； 巴尔通体； gltA基因； 系统发育分析

　　Analysis of phylogenic diversity of Bartonella in Yunnan Province.

　　YANG Fa-lian, BAI He-ming, YANG Hui.

　　( Yunnan Provincial Institute of Endemic Diseases, Dali 671000, Yunnan, P. R.China )

　　Abstract: Objective  To investigate the phylogenic diversity of Bartonella in Yunnan Province,P.R.China, by using phylogenetic analyses based on gltA gene sequence comparisons.  Methods  The 32 variants (gltA gene) of Bartonella isolated in Yunnan Province and published in GenBank from 1999 to today were taken as the target strains. The most closely related typical strains searched by BLAST in GenBank with sequencing program were taken as comparative stains and their gltA gene sequences were compared each other.  Phylogenetic analyses were performed after the multiple alignment of sequence data by ClastalX.  Results  The results showed that 32 Bartonella variants were belonged to seven branches including B.elizabethae, B.tribocorum, B.grahamii, B.washoensi, B.taylrii, B.phoceensis and B.yunnannensis.  There sequences of the glrA gene of a variants in the same branch were, to a varied degree, diffenrent and hereditary variations were also noticed in some variants.   Conclusion  The Bartonella in Yunnan not only shows phylogenetic diversity , but also shows specificity and there may be a potential species. In addition, it may be possible that some unknown diseases might be associated with Bartonella infection.

　　Key words: Yunnan;  Bartonella; gltA gene; Phylogenetic analysis

　　巴尔通体（Bartonella）是一新发现的古老病原体，迄今已发现21种及3个亚种,其中有9个种与人类感染密切相关[1，2]。因巴尔通体种类多，感染引起的疾病谱比较复杂，给人类健康带来巨大的威胁，日益引起国内外学者的关注。我国相关研究开展较晚, 1999年云南的白瑛等首次在鼠群中开展巴尔通体调查证实巴尔通体在云南普遍存在[3],至今已对16个县（市）进行了巴尔通体感染的调查。从黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、斯氏家鼠、大绒鼠、齐氏姬鼠、中华姬鼠、大林姬鼠、小家鼠、锡金小鼠、灰麝鼩5个属的11个鼠种及其寄生蚤中先后分离到巴尔通体100多株[4，6]。其中近百株经巴尔通体gltA基因的379bp片断进行了序列测定,并提交基因库，所有菌株依基因结构可将它们分为32个变异体，并已在GenBank中公布。有些变异体仅包括1株菌，有些则包括来自不同地区同一宿主或不同宿主的多株菌。1种变异体中所含菌株数最多达15株[3]。为深入研究，现对已提交基因库并在GenBank中公布的云南32个巴尔通体变异体进行序列分析,结果如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  菌株

　　1.1.1  目标株  云南1999年至今先后分离到的并已在GenBank中公布的巴尔通体变异体（gltA基因）为目标株。

　　1.1.2  对比株  利用网上核酸序列比对程序BLAST（美国国家生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov）进行核酸序列同源性搜索,调出相似性最高且有效发表种典型菌株为对比株。

　　1.2   gltA基因序列的系统发育分析　　用ClastalX进行碱基配对及多序列比对，种系发生分析采用PHYLIP软件包中的Dnadist（Kimura两参数法）、Neighbor（邻系接合法），限制性种系发生的确信限度估计用100个拷贝由自助法完成。PHYLIP软件包中的距离基质法采用Seqboot、Dnadist、Neighbor和Consense软件。构建NJ系统进化树。

　　2 结果和讨论

　　2.1  GenBank中公布的云南巴尔通体变异体（gltA基因）的地区分布  云南从99年至今先后分离到的并在GenBank中公布的32个巴尔通体变异体分别来自宜良、保山、剑川、盈江、澜沧、龙陵和思茅 7县（市），分离自黄胸鼠（R.t.flavipectus）、褐家鼠（R.noruigicus）、大绒鼠（E.miletus）、齐氏姬鼠（A.chevrier）、中华姬鼠（A.draco）和大林姬鼠（A.peninsulae）6个鼠种及印鼠客蚤（Xenopsylla）和泸水栉眼蚤（Ctenophthalmus Lushuiensis）2种寄生蚤，见表1。

　　表1. GenBank中公布的云南32个巴尔通体变异体（gltA基因）的地区分布（略）

　　Table 1 TO publish 32 genetic variants of Bartonella in GenBank and Geographic distribution in Yunnan

　　可见巴尔通体在云南普遍存在，且在常见鼠群中广泛分布及高度流行。黄胸鼠和齐氏姬鼠为云南家、野两型鼠疫的主要宿主，巴尔通体感染与鼠疫之间有无联系?弄清这个问题对今后的疾病防治有着重要的意义。目前GenBank中公布的云南巴尔通体(gltA基因)有32个基因变异体，说明云南巴尔通体基因型别的多样性较丰富。

　　2.2   基于gltA基因序列的系统发育多样性分析　　用Blast搜索软件从GenBank中进行相似性搜索，调出相似性最高且有效发表种典型的菌株的有效序列（表2），用ClastalX进行多序列匹配比对，然后用PHYLIP中相关软件进行系统进化树的构建（图1）。结果表明，32个巴尔通体变异体可归为7个分枝(RfLC84YN、RfLC04YN、RfLC80YN和RfLC40YN可归于B.tribocorum一枝,已报道[7],进化树在此未给出.)其代表菌株有效发表种分别为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis及云南单独存在的B.yunnannensis，曾报道[3]。32种变异体的归属和其gltA基因部分序列与其代表菌株有效发表种序列相似性分别为B.tribocorum（3个：Rf1563yn、RN10631LA和RfLC52YN，相似性均为96%）；B.tribocorum（8个：RN10 -149MD、RN10623LA、F47YN、Rf1570yn、RfLC40YN、RfLC80YN、RfLC84YN和RfLC04YN，相似性为99%～93%）；B.grahamii（8个：Ap1707yn、Ac1692yn、Ad1734yn、Ap1714yn、Rf1561yn、Rf1554yn、Ac1727yn和Ac1825yn，相似性为97%～93%）；B.washoensis（1个：Ac1826yn，相似性为97%）；B.taylrii（6个：Em1531yn、F16YN、F13YN、F14YN、F12YN和Em1712yn，相似性为97%～94%）；B.phoceensis（2个：Ap1699yn和Ac1693yn，相似性均为97%）；B.yunnannensis（4个：Rt222sm 、Ac1723yn、RfYJ41YN和Rn1691yn，相似性均为99%）。 

　　图1  云南32个巴尔通体变异体及其从GenBank中调集的相关种构建的以gltA基因序列为基础的系统进化树（略）

　　Fig.1 Neighbor-Joining tree constructed showing the phylogenetic relationships 32 genetic variants of Bartonella in gltA gene sequences obtained from the Yunnan isolates and their closely related sequences downloaded from GenBank.

　　表2  云南32个巴尔通体变异体（gltA基因）与其系统发育关系最密切且有效发表种典型的菌株（略）

　　Table 2  Phylogenetic nearest neighbors and typical of strains and 32 genetic variants of Bartonella in yunnan by analysis of the gltA gene sequence
   
　　32个基因变异体大体可分为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis和B.yunnannensis等7个分枝，每一个分枝的代表菌株均是有效发表种，可见云南巴尔通体具有种类多样性。值得注意的是其中B.elizabethae、B.grahamii和B.washoensis[8]是已证实的人类致病菌，一些不明原因的疾病有可能与巴尔通体的感染有关不容忽视。同一枝中所有分离的变异体与其发育关系最密切且有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列均有不同程度的差异。这些结果揭示云南巴尔通体不仅具有系统发育多样性而且还具有其特异性。

　　同一枝中部分分离的变异体与有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列相似性较低（94%～93%），说明部分变异体与有效发表种典型的菌株间存在较大的遗传差异，可能有潜在的新种。

　　B.yunnannensis一枝为云南独有,表明云南巴尔通体较其他国家的菌株更具多样性。

【参考文献】
  　　［1］ Maguina C,Cotuzzo E. Bartonellosis; New and old［J］.Infect Dis Clin North Am.2000,14:1~22.

　　［2］ 白鹤鸣.巴尔通体菌［J］.微生物学杂志，2005，25（6）：70~72.

　　［3］ 白瑛，Kosoy MY, Maupin GO,等.首次证实巴尔通体在我国云南鼠群中流行［J］.中国人兽共患病杂志，2002，18：5~9.

　　［4］ 白瑛，王国良,等.从云南省滇西南地区鼠群中分离到巴尔通体［J］.中华流行病学杂志，2003，24(增刊)：96~98.

　　［5］ 栗冬梅，俞东征,刘起勇，等.云南省不同环境鼠形动物巴尔通体感染情况的研究［J］.中华流行病学杂志，2004，25（11）：934~937.

　　［6］ 杨发莲.巴尔通体在云南省的调查研究［J］.地方病通报，2005，20（1）73~74.

　　［7］ 杨发莲，白鹤鸣，杨慧，等.云南澜沧巴尔通体的分离鉴定和序列分析［J］.现代预防医学，2007，34(19)3601~3603.

　　［8］ Kosoy M, Murray M,Gilmore RD, et al.Bartonella strains from ground squirrels are identical to Bartonella washoensis isolated from a human patient［J］.Clin Microbiol,2003,41:645~650.

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