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【摘要】 目的 探讨检测脑膜炎球菌多糖菌苗多糖含量的新方法。 方法 将制备的脑膜炎奈瑟菌相应群兔抗血清加入熔化的琼脂糖凝胶，待冷却后于凝胶板上打孔，再将菌苗进行一定梯度稀释后加样于凝胶孔，在电场作用下，多糖抗原与抗血清形成的结合物在凝胶内泳动形成火箭状。通过不同多糖含量梯度的迁移距离进行线性回归分析，从而对菌苗多糖含量进行计算。 结果 将抗原稀释到一定浓度后进行火箭免疫电泳，电泳形成的火箭峰高度与抗原浓度呈正相关。 结论 运用火箭免疫电泳可以有效地测定脑膜炎球菌多糖菌苗中的多糖含量。
【关键词】 多糖含量；脑膜炎球菌多糖菌苗；火箭免疫电泳
Detection of content of polysaccharide in meningococcal polysaccharide vaccine.
CHEN Meng-jia, CHEN Yi-lin, JIN Wei-ping, TAN jian-xin, et al.
(Zhejiang Tianyuan Bio-pharmaceutical Co., LTD, Hangzhou 311100, Zhejiang, P. R. China )
Abstract: Objective To determine the content of polysaccharide in meningococcal polysaccharide vaccine . Methods The specific rabbit antiserum prepared with Neisseria meningitidis was added to melted agrose and holes were made on the agrose plate when it was coagulated . Then polysaccharide was asslowed to react with the antiserum. The complex of antigen and antiserum moved in the gelatine and formed as rocket. Rocket Immunoelectrophoresis was performed and the concentration of polysaccharide was analyzed. Results The precipitation peak formed by rocket immunoelectrophoresis correlated with the concentration of polysaccharide when the antigen diluted to a suitable concentration. Conclusions The content of polysaccharide of meningococcal polysaccharide vaccine can be determined by rocket immunoelectrophoresis .
Key words: Neisseria meningitidis; Content of polysaccharide; Meningococcal polysaccharide vaccine; Rocket immunoelectrophoresis
流行性脑脊髓膜炎主要是由脑膜炎奈瑟菌引起的乙类传染性疾病，在我国是以A群脑膜炎球菌的流行为主，但近年不断有C群、Y群和W135等群流行的报道，严重危害人民的生命和健康。接种菌苗是有效预防细菌性脑膜炎的最好方法，我国也于2008年开始开展针对细菌性脑膜炎的A群C群脑膜炎球菌多糖菌苗国家计划免疫。
而菌苗多糖含量是菌苗质量的一个关键指标，对菌苗多糖含量检测方法[1、2]，尤其是对ACYW135群脑膜炎球菌多糖菌苗，是困扰生产企业的关键检测技术。为此欲探讨运用火箭免疫电泳法能否快速有效地对生产的菌苗进行多糖含量测定。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌种 A群29201 (A4)、C群C11 29205、Y群CMCC 29028及W135群CMCC 29037菌株，为浙江天元生物药业股份有限公司菌苗生产用菌种，原始种子均来源于中国药品生物制品检定所。
1.1.2 实验动物 实验家兔由浙江省动物中心引进。
1.1.3 参照抗原 脑膜炎球菌多糖参照抗原由浙江天元生物药业股份有限公司研发中心提供，脑膜炎球菌多糖菌苗和菌苗原液为浙江天元生物药业股份有限公司2008年度生产产品。
1.2 群特异性兔抗血清制备 实验家兔免疫前观察3天，确认家兔健康后用。
将以上各菌种复苏于巧克力培养基，复苏后刮取第一代菌苔传代于巧克力培养基置37℃培养16h，收集培养物并刮入生理盐水中研磨均匀；将菌液稀释至浓度为20亿/ml，家兔耳静脉注射菌液0.5ml/只；每隔3天将新鲜培养物分别制成30亿/ml、40亿/ml和60亿/ml的菌液，给家兔耳静脉注射菌液0.5ml/只。免疫第四针后7天于家兔颈动脉采血，采的血置37℃放置1h后再于2~8℃放置过夜，并于第二天离心分离血清备用。
1.3 火箭免疫电泳及分析计算 按每20ml熔化的琼脂糖凝胶加入群特异性脑膜炎球菌抗血清500ul，分别用不同浓度梯度参照抗原进行电泳。对各浓度梯度参照抗原形成的电泳条带长度进行直线回归分析，选取回归线性比较好的浓度梯度作为多糖含量测定的参照计算标准[3]。实验中分别选用4种不同浓度抗原梯度系列，即0、20、40、60、80和100ug/ml，0、10、20、30、40和50ug/ml，0、5、10、15、20和25ug/ml，0、2、4、6、8和10ug/ml，各浓度梯度系列分别进行三次电泳。以5V/cm进行电泳100min；电泳完毕后将凝胶置于生理盐水中浸透2h以上，然后用滤纸将凝胶水分吸干并置烘箱烘干成凝胶膜，经考马斯亮兰染色液染色后脱色至电泳条带清晰，测量各电泳条带并进行直线回归分析。
2 结果
0、20、40、60、80和100ug/ml浓度梯度参照抗原组进行3次电泳后直线回归获得的R2值分别为0.9531、0.9600和0.9218；0、20、40、60、80和100ug/ml浓度梯度组三次电泳的线性回归R2值分别为0.9086、0.9416和0.9028；0、10、20、30、40和50ug/ml浓度梯度组的R2值分别为0.9086、0.9416和0.9028；0、5、10、15、20和25ug/ml浓度梯度组的R2值分别为0.9977、0.9868和0.9922；0、2、4、6、8和10ug/ml浓度梯度组的R2值分别为0.9808、0.9677和0.9844。
其中0、5、10、15、20和25ug/ml浓度梯度线性最好，三次实验获得的相关系数值均能保证在0.98以上，0、2、4、6、8和10ug/ml浓度梯度稍差，但其相关系数也控制在0.96以上；而另两种浓度梯度的线性比较差，而且容易出现反复，相关系数基本≤0.96。
根据实验结果，可以采用0、5、10、15、20、25ug/ml或0、2、4、6、8、10ug/ml浓度梯度作为火箭免疫电泳法进行脑膜炎球菌多糖菌苗多糖含量测定的参照计算梯度。利用0、2、4、6、8、10ug/ml浓度梯度作为参照计算梯度对脑膜炎球菌多糖菌苗原液、菌苗成品及菌苗分子大小检测实验中的层析洗脱液的电泳证实该方法可以快速有效检测各群菌苗的多糖含量[图1]（见图1）。
图1：C群参照抗原多糖含量火箭免疫电泳测定结果（略）
注：1、2为2ug/ml多糖溶液，3、4为4ug/ml，5、6为6ug/ml，7、8为8ug/ml，9、10为10ug/ml；13、14为菌苗原液1000倍稀释样品，15、16为菌苗成品10倍稀释样品，17、18为成品分子大小测定时层析洗脱液3倍稀释样品。
3 讨论
目前，引起我国细菌性脑膜炎流行主要为A群和C群脑膜炎奈瑟菌，相应地，菌苗预防接种也主要以A群和C群脑膜炎球菌多糖菌苗为主。对该两类菌苗的多糖含量测定也可以通过测定产品中的磷含量和唾液酸含量来推算菌苗中的多糖含量。但是，近年我国不断有W群和Y群奈瑟菌引起脑膜炎的报道，各菌苗厂家也在不断开发覆盖范围更广泛的ACYW135群脑膜炎球菌菌苗；而对于ACYW135群脑膜炎球菌多糖菌苗，用现有的药典方法将无法分别检验制剂中C群、Y群和W135群脑膜炎球菌多糖菌苗含量[4]。利用本实验中探索的抗原浓度梯度作为参照，将可以用火箭免疫电泳方法快速有效地检测制剂中不同群菌苗多糖含量。
但是，作为一项新的检验方法，要形成以标准的实验方法被列入国家药典，尚需更多的验证工作。实际工作发现，不同群脑膜炎奈瑟球菌免疫家兔制备的抗血清用于该实验，其效果不尽相同；同群脑膜炎奈瑟球菌免疫不同家兔制备的抗血清用于该实验所获得的电泳效果也差别很大。实际运用中，有必要对各群、各家兔免疫的抗血清分别进行必要的实验体系优化、验证，以获得最佳的实验条件和实验结果。
【参考文献】
［1］ WHO TRS 658 Annex 6. 174-184.
［2］ WHO TRS 594 Annex 2.
［3］ 周海钧主编. 药品生物检定. 北京: 人民卫生出版社, 2005, 89～93.
［4］ 50-75.国家药典委员会. 中华人民共和国药典2005版三部. 第一版. 北京: 化学工业出版社, 2005: 34～36.
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