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【摘要】 目的 研究大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒后芦丁等黄酮类成分在血浆、肝、肾、小肠及小肠内容物中的分布。 方法 大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒溶液（0.9g·100g-1）按时间取血、肝、肾、小肠等组织及小肠内容物，血浆及组织酶水解样品及小肠内容物样品用二极管阵列检测高效液相色谱法(HPLC-DAD)测定。 结果 大鼠血浆中被检测到至少3个代谢产物，其中之一是槲皮素，未知物没有鉴定。小肠组织有芦丁等多种黄酮类化合物，肝中发现未知化合物而肾中则未发现。 结论 枫蓼肠胃康颗粒可能起靶向治疗作用。
【关键词】 枫蓼肠胃康颗粒；血浆；小肠内容物；小肠组织；芦丁；槲皮素; HPLC-DAD
Investigation into the distribution of Fengliaochangweikang granules in tissues of rats.
CHEN Feng, FU Nai-guang, LIU Ming-sheng, et al.
(Pharmaceutical Department of Hainan Medical College，Haikou 571100, Hainan, P. R.China）
Abstract: Objective To investigate the distribution of flavonoids in rat tissues,including plasma,liver,kidney,small intestine after oral administration of Fengliaochangweikang granule. Methods The rats were administrated Fengliaochangweikang granule solution（0.9g·100g-1）by oral administration ,then the blood sample and the tissue samples were prepared. After hydrolyzed by the enzyme, the analytes of interest were separated and analysed by HPLC-DAD. Results Quercetin were identified through comparing with the standard spectrum but the two other metabolites in rat plasma were not identified. Many kinds of flavonoids from small intestine samples were found ,but there were no flavonoids in the kidney tissue samples. Conclusion Fengliaochangweikang granule might have a targeted therapeutical effect on acute gastroenteritis.
Key Words: Fengliaochangweikang granule; Plasma; Intestinal contents; Distribution in tissues; Rutin; Quercetin;
HPLC-DAD
海南枫蓼肠胃康颗粒由辣蓼（Polygonum flaccidum Meism.）和牛耳枫（Daphniphyllum calycinum Benth.）组成，临床上用于治疗急性胃肠炎和浅表性胃炎。先前对该复方药效物质基础进行了研究，确定有效成份由至少五种黄酮类成分组成的一组混合物（专利申请号：200510071092.3公开号： CN1843418）。
黄酮类化合物具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、扩张血管和降血糖等多种药理活性，受到了国内外医药界广泛的重视[1,2]。本文旨在研究大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒后，大鼠血浆、肝、肾、小肠及内容物中黄酮类化合物的分布情况，观察各样品中芦丁、槲皮素随时间的变化规律，探索枫蓼肠胃康颗粒剂在大鼠体内是否具有靶向治疗的作用特点。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲料 雄性SD大鼠从四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所购买，许可证号：SCXK（川）2004-15。每笼2只，饲养环境温度控制在20℃，适应时间为期2周。大鼠饲料从长沙市开福区东创实验动物科技服务部购买，主要组成为：粗蛋白24.2%，粗脂肪4.5%，粗纤维4.2%，钙1.33%，磷0.8%，含水量6.8%。
1.2 仪器与试药
1.2.1 仪器 美国waters公司液相色谱仪（包括515型输液泵，2996型光电二极管阵列检测器，717型自动进样器）。美国waters公司DOA-V130-BN真空泵，美国PALL公司CascadeIX超纯水器，日本KUBOTA公司KR-702型离心机，美国Organomation N-EVATM111氮吹仪。
1.2.2 药品与试剂 枫蓼肠胃康颗粒（海口制药厂有限公司生产，批号20070808）。槲皮素对照品购自中国药品生物制品检定所，批号分别为100081-200406；芦丁对照品购自天宝物华，批号20050722，均为HPLC含量测定用。Sulfatase（G1512）从Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司购买。甲醇与乙腈均为色谱纯（美国TEDIA公司），磷酸、乙酸、丙酮等试剂均为分析纯，医用生理盐水。
1.3 血浆样品采集 称取SD大鼠（170g-260g）置于代谢笼中，禁食24小时，自由饮水，以0.9g·100g-1的剂量灌胃（ig）给枫蓼肠胃康颗粒水溶液，给药后2h，4h,6h,8h,12h后，腹腔注射戊巴比妥溶液使之麻醉，从腹腔静脉取血（约5毫升），全血样品置已肝素化的试管中，立即于4℃下离心分取血浆，置-20℃冷冻贮存，备用。
1.4 血浆样品处理 取900μL血浆于4ml小瓶（waters，P/N186000838C，）加入100μL浓度为0.583mol· L-1的乙酸溶液调节pH至4.9，漩涡混匀，加入2.5×104U/L Sulfatase（G1512）水解酶，密闭。在37℃水浴中水平振荡60min，平均分成2份，每份加入6倍于取样体积的丙酮水平振摇30min，样品在4℃下以4000r/min离心30min，合并上清液N2吹干，再用0.2ml甲醇溶解残渣，过0.45μm滤膜，得样品，进样40μL[3，4]。
1.5 组织样品处理 取血之后的大鼠立即分离小肠、肝、肾，用冷生理盐水漂洗，滤纸吸干，称重，立即于-40℃冰箱冻存备用。小肠内容物用50%甲醇-0.1mol·L-1 H3PO4缓冲液（pH7.0）冲洗各内容物至无残留，最后定容至10ml，4000转·min-1离心20min，取上清液过0.45μm滤膜，得样品，备用。
分别取肝、肾及小肠等组织，置50ml离心管中，加入5.0ml缓冲液（pH5.0）与5.0ml甲醇，用组织分散机捣碎，匀浆，离心，平均分成2份。其中之一用N2吹尽甲醇，然后加入Sulfatase（G1512）4mg，于37.5℃水浴中孵化1h，然后加入6倍体积的丙酮，振荡均匀，在4℃下以4000r/min离心30min，取上清液，N2吹干，以0.8ml甲醇溶解残渣，过0.45μm滤膜，得样品，进样40μL。另一份不加Sulfatase（G1512），其余处理方法皆同前述。
1.6 色谱条件 血浆样品色谱条件：Diamonsill C18柱（250mm×4.6mmID,5μm粒径）（迪马公司），流动相为甲醇-0.2%磷酸（50：50），波长365nm，流速为1ml·min-1，温度为30℃；小肠、肝、肾及肠道内容物样品色谱条件：Diamonsill C18柱（250mm×4.6mmID,5μm粒径）（迪马公司），乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱，见下表1），紫外检测波长为200-400nm，温度为30℃。每个样品运行结束后延迟5min进样。
表1 梯度洗脱设计表（略）
2 结果
2.1 血浆样品HPLC检测结果 与空白对照相比，出现三个黄酮类代谢产物，其中保留时间为8.667min为槲皮素，后面2个是未知物，如图1所示。
图1 空白血浆样品和给药血浆样品色谱图（略）
Fig 1 Representative HPLC chromatogram of plasma obtained after oral FengLiaoChangWeiKang Granule solution（0.9g·100g-1）, with enzymatic treatment.Control plasma (A) and treatment sample(B).
在研究中发现，保留时间在29.506前后的色谱峰只出现在8h以后（含8h）的血浆样品中，该代谢物有可能是颗粒剂中的黄酮类成分通过盲肠及结肠菌群代谢后再吸收进入血液循环，该代谢物以及另一未知物的结构有待进一步的工作来确定。
2.2 小肠、肝、肾样品HPLC结果
图2 小肠组织样品色谱图（略）
A：小肠空白；B：小肠组织样品；C：小肠组织加酶处理。
Fig 2 Representative HPLC chromatogram of small intestine tissue samples after enzmy hydrolyzed A- control sample B-small intestine tissue sample C- small intestine tissue samples after enzmy hydrolyzed
A肝空白； B肝酶水解样品
图3 肝组织样品样品图（略）
Fig 3 Representative HPLC chromatogram of liver tissue samples after enzmy hydrolyzed.A- control sample B-liver tissue sample after enzmy hydrolyzed
A肾空白； B肾酶水解样品
图4 肾组织样品色谱图（略）
Fig 4 Representative HPLC chromatogram of liver tissue samples after enzmy hydrolyzed.A- control sample B-kinday tissue sample after enzmy hydrolyzed
从图2～4显示，在相同样品处理及相同色谱条件下，小肠、肝、肾组织样品中黄酮类化合物的分布有显著的差异。其中，在肾组织样品中空白样品和给药样品色谱图基本一致，没有发现具有典型黄酮吸收的化合物。肝组织样品色谱中，与空白样品比较，给药样品在保留时间5.9min和29.3min处有两个未知化合物出现。小肠组织样品中含有丰富的黄酮类化合物，保留时间在20min以内的色谱峰所对应的物质都来自于枫蓼肠胃康颗粒；加入G1512酶水解后，在26min和29min附近出现两个新化合物的色谱峰。这些黄酮类化合物除了芦丁是已知物质外，更多的属于未知物，有待进一步鉴定。
2.3 小肠内容物芦丁含量变化结果 小肠内容物内容物与枫蓼肠胃康颗粒剂样品基本相似，只是在量上面有较大差异。肠道内容物中芦丁随时间的变化而变化。
灌胃后，小肠内容物中芦丁含量迅速减少，在4h的小肠组织样品中（酶水解和不水解）检测出芦丁的量有近给药量的（22.11±59）％，更多的是未知的黄酮类化合物。6h的样品中的芦丁含量很低为（6.54±4.53）%，8h为（2.51±0.85）%。另外，研究大肠内容物中槲皮素的含量时发现，随着时间的推移，槲皮素的含量逐步增加，在8h的样品中观察到超出给药量的槲皮素（110％），而此时胃肠道内容物中芦丁含量已经很低，可能是肠道代谢所致，这一发现还有待于进一步的验证。
3 讨论
3.1 在血浆酶水解样品处理时，采用6倍量丙酮来终止反应，之后得到的丙酮上清液是吹干还是浓缩至一定体积，文献报道不同[3,4]。我们研究发现，如果浓缩至一定体积，给后面的过虑造成一定的困难，也影响检测；如果吹干后再用少量甲醇复溶，则很容易过滤并且可得到较高浓度的样品溶液，有利于检测。
3.2 关于槲皮素和芦丁在胃肠段的吸收位置，有大量文献报道。Crespy V[5]等认为槲皮素在大鼠胃即被吸收，而其苷类物质则不然。多数文献认为槲皮素的主要吸收位置在小肠，芦丁则是通过大肠菌群代谢后才被吸收[4，6，7]。在研究中曾发现的大肠内容物中槲皮素的大量出现及芦丁的迅速减少也可证明这一观点。当然，多数文献使用纯化合物或添加纯化合物的饲料进行研究而我们是用中医药理论指导下的中药复方制剂，势必存在差异，其机制应复杂的多。
3.3 枫蓼肠胃康颗粒是一治疗急性胃肠炎的常用制剂，是局部作用还是有效成分吸收后的全身作用？本研究中发现，小肠组织和内容物中出现大量的黄酮类化合物，提示这类物质可能在胃肠段发挥抗炎和解痉作用以缓解急性胃肠炎的症状，发挥局部靶向治疗作用。
【参考文献】
［1］ Crespy,V.,Morand,C.,Besson,C.,et al.Comparison of the intestinal absorption of quercetin, phloretin and of their glucosides in rats［J］.J. Nutr.2001，131(8):2109~2114.
［2］ Claudine M,Gary W,Christine M,et al.Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans.I.Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr 2005;81(suppl):230S~42S.
［3］ Ader P,Wessmann A,Wolffram S,et al.Bioavailability and metabolism of the flavonol quercetin in the pig［J］.Free Radic Biol Med.2000，28(7):1056~1067.
［4］ Manach,C.,Morand,C.,Demigné,C.,et al.Bioavailability of rutin and quercetin in rats［J］.FEBS Lett.1997，409:12~16.
［5］ Crespy V,Morand C,Besson C,et al.Quercetin,but not its glycosides, is absorbed from the rat stomach［J］.J Agric Food Chem 2002，50(3):618~621.
［6］ Brigitte A.Graf,William Mullen,Stuart T.Caldwell,et al.Disposition and metabolism of ［2-14C］quercetin-4'-glucoside in rats［J］. Drug Metab Dispos，2005,33(7):1036~1043.
［7］ PEI L K ,GUO B L. Advances in studies on absorption and metabolism of flavonoid［J］. Chin Pharm J（中国药学杂志），2006,41(8):568~572.
作者单位：