帕金森病模型大鼠经颅磁刺激运动诱发电位波幅的研究

【摘要】  目的：探讨帕金森病(ＰＤ)模型大鼠经颅磁刺激运动诱发电位波幅的变化(amplitude of motor evoked potential ，MEP amp)。方法：实验分两组，健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，随机分为2组：①实验组（PD模型组）28只，②对照组（生理盐水组）12只，选取右侧黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）与中脑腹侧背盖（ventra tegmental area,VTA）为手术靶点，实验组注射6－羟基多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病动物模型，对照组注射同等剂量的生理盐水，于制模前、制模后1周、3周分别行双下肢运动诱发电位波幅检查。结果统计采用SPSS11.5统计软件处理， P<0.05为差异有显著性。结果：术后1周，实验组大鼠左下肢MEP amp与对照组比较无统计学意义（P>0.05），实验组自身左右侧TMS-MEP比较，左下肢波幅较右下肢增加（P<0.05）；制模前、术后1周、术后3周实验组大鼠左下肢MEP amp进行性增加（P<0.01），实验组大鼠右下肢波幅三个时间点比较无统计学意义（P>0.05）；对照组大鼠左侧及右侧下肢波幅三个时间点比较均无显著性差异(P>0.05)。结论：PD模型大鼠损毁侧皮层兴奋性增加，PD模型大鼠病情越重、病程越长，波幅增加越明显。

【关键词】  帕金森病模型 大鼠 经颅磁刺激 运动诱发电位 波幅

    The study of amplitude of motor evoked potential of Motor evoked potentials

    by transcranial magnetic stimulation for model rats of Parkinson's disease

    SUN Li-jun，ZHAO Shi-gang，LI Chun-yang

    【Abstract】  Objective：The aim of the research is to make clear if PD has amplitude of motor evoked potential of TMS-MEP abnormality and if amplitude of motor evoked potential changes with the developing state of an illness. Methods:Rats were randomly assigned into either experimental group (n=28) or control group (n=12), select the operated target in right substantia nigra pars compacta (SNc) and right ventra tegmental area (VTA). SNc and VTA were injected each 2μl (4μg /μl 6-OHDA in PBS) solution of 6-OHDA in experimental group. Saline containing 2% vitamin C with isometry injected to same location in control group. Examinating amplitude of motor evoked potential(MEP amp) before operation, a week and three weeks later after operation. Statistical analysis was done using SPSS11.5 software.Results: There were no significant difference of TMS-MEP (P>0.05) between the experimental group and control group before operation. Left lower limb compared with right lower limb for the experimental group and the control group before operation has no significant difference (P>0.05). A week after operation, There was no significant difference of MEP amp of left lower limb between the experimental group and the control group (P>0.05). There was no significant difference of TMS-MEP of right lower limb between the experimental group and the control group (P>0.05). Three weeks after operation, MEP amp of left lower limb was significantly high in the experimental group (P<0.01) as compared with the control group. There was no significant difference of TMS-MEP of right lower limb between the experimental group and the control group (P>0.05). In the experimental group, MEP amp of left lower limb significantly higher than right (P<0.01). In the control group, there was no significant difference between left lower limb and right lower limb with respect toMEP amp, In the experimental group of left lower limb, comparison before operation and after operation one week and three weeks later, MEP amp was gradually increased (P<0.01).Conclusions: Our study revealed the cortex excitability was increased. PD model Following state of the illness got worse and the course of disease got longer in PD model rats, the cortex excitability was more increased.

    【Key words】Parkinson's disease model; rats; transcranial magnetic stimulation; motor evoked potentials; amplitude of motor evoked potential

    以往的观点认为PD的病变限于锥体外系统，随着神经电生理学的发展，发现PD除锥体外系病变外，其它神经通路也受累，对帕金森病TMS-MEP的研究，目前尚无一致结论，且均为对PD病人的TMS-MEP的研究，因临床病人的混杂因素多，很难达到一致性，为此，本实验拟采用6-OHDA右侧黑质致密部和中脑腹侧背盖两点注射法制备偏侧帕金森病大鼠模型，对模型大鼠于不同时间点行TMS-MEP检测，观察帕金森病是否存在运动传导通路的损害，以及TMS-MEP是否随着病情变化。

    1  材料与方法

    1.1  动物及分组  健康SD雄性大鼠40只，由河北医科大学实验动物中心提供，体重270~300 g，鼠龄3~4个月，经行为检测确认无旋转行为后将40只大鼠随机分为2组：①实验组（PD模型组），28只大鼠制备6-OHDA PD模型，随机选取模型成功的大鼠12只，观察制模型前后的波幅变化；②对照组（生理盐水组），12只大鼠，用于实验对照，观察手术前后的波幅变化。

    1.2  帕金森病大鼠模型的制备  PD大鼠模型制作　制作PD大鼠模型: 10%水合氯醛 0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉，头颅水平位固定在大鼠脑立体定位仪上，上切牙平面比耳间线平面低2.4 mm(即齿棒低于耳间线)，保证前、后囟处于同一水平面，剃除大鼠头顶部毛发，手术区消毒，于颅中部正中切开头皮和筋膜，切口长度1.5cm，剥离骨膜，使前囟充分暴露，确定右侧SNc、VTA三维坐标位置。SNc区坐标:前囟后4.8 mm，中线右侧1.0 mm，硬膜下7.8 mm。VTA区坐标:前囟后4.4 mm，中线右侧1.2 mm，硬膜下7.8 mm，确定具体坐标并标记，用牙科钻，小心钻透颅骨，用5 μl微量注射器抽取4 μg/ul 的6-OHDA溶液（含0.2%VitC的生理盐水）4 ul，按坐标每个点注射2 μl，注射时缓慢进针，注射速度1 μl/min，注射完毕停针10分钟，按1.0 mm/min速度缓慢拔针，明胶海绵填塞颅骨孔，缝合皮肤、筋膜。术后青霉素（5万单位/天）腹腔注射一周，预防感染。

    1.3  假手术组大鼠的制备  用上述同样方法向两坐标点每点注射2μl生理盐水(含0.2%VitC)。

    1.4  行为检测  术后1周开始行为检测，应用阿朴吗啡(Apomorphine,APO)腹腔注射(0.5 mg/kg体重)，观察大鼠旋转行为变化，每周一次，连续6周，观测时间为30分钟/次，规定大鼠恒定转向左侧、身体环曲、首尾相接、360度为一转(r)、且旋转圈数>210 r/30 min，为成功PD大鼠模型, 否则予以淘汰。若大鼠不出现旋转、旋转方向不恒定、恒定转向右侧或恒定转向左侧但速度较慢(<210 r/30 min)，则视为失败PD模型。

    1.5  经颅磁刺激运动诱发电位的检查  所有大鼠于术前、术后1周、3周均行双下肢TMS-MEP检查。大鼠TMS-MEP在安静的电屏蔽室(室温20~24℃)内记录。10％水合氯醛 0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，使用Magstim220型磁刺激仪和S90型圆形线圈，外径9.0 cm，最大输出磁场强度1.9Tesla，磁线圈的放置方式为刺激左侧大脑半球时线圈A面向上，刺激右侧大脑半球时B面向上。每两次磁刺激间隔至少5秒，以防止上一个刺激对下一个刺激的易化。将线圈的中心放置在国际脑电图10~20系统Cz部位，适当移动线圈的位置，用刺激器最大输出量60%的刺激强度在大脑半球对侧下肢记录到最短潜伏期、最大波幅的部位为最佳刺激部位，将该部位标记。将线圈的中心置于标记处并与头皮相切，线圈柄朝后，每次测试至少重复刺激2次以获得稳定的波形，电容放电最大输出1000A。以阈上30％的刺激量诱发出最短潜伏期的MEP，记录此时的MEP波幅。

    1.6  记录  同心圆针电极置于双下肢腓肠肌肌腹作为记录电极，记录头皮刺激的对侧下肢腓肠肌的诱发肌电位，单极针电极置于鼠尾作为接地电极，各电极阻抗均小于5 kΩ。磁刺激信号经Counterpoint型肌电图仪放大，滤波带通20～2000 Hz，分析时程50 ms。

    1.7  统计方法  将实验组第1周时APO诱导符合PD成模标准的大鼠随机抽取12只，将其TMS-MEP数据与对照组比较。本实验全部采用SPSS11.5版本进行统计分析。主要采用2种统计方法:①对同一时间点不同处理组间实验数据的比较采用两样本均数比较的t检验，各组内同一时间点左右侧运动诱发电位的比较采用配对t检验。②3组以上成组资料均值比较采用完全随机的单因素方差分析（采用该方法分析的数据全部经过方差齐性检验及正态性检验），在有意义的情况下行两两比较的q检验。所有数据均以均数±标准差表示，P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  一般观察  生理盐水组所有大鼠术后均正常生存。实验组有3只大鼠于术后死亡，其余大鼠经APO诱导有18只符合PD成模标准，

    2.2  术后大鼠神经症状和体征  术后一周开始给予腹腔注射APO，观察其诱导旋转行为变化，模标准，3周后20只出现恒定向左侧旋转行为，其中18只达到PD模型标准，模型成功率为62.28%，术后4、5、6周恒定向左侧旋转大鼠数量未见增加，术后3周与术后1周行为检测，大鼠旋转圈数有所差异，术后3周的旋转圈数较术后1周增加，具统计学意义（P<0.05）。旋转行为一般于腹腔注射APO后15 min内开始出现， 5只大鼠始终无旋转，生理盐水对照组大鼠APO诱导无旋转行为及其它异常行为。

    2.3  大鼠经颅磁刺激运动诱发电位的观察  ①制模前实验组大鼠左下肢及右下肢MEP amp与对照组比较，无统计学意义(P>0.05)。实验组及对照组大鼠自身左右下肢MEP amp比较均无统计学意义(P>0.05)②制模后1周，实验组大鼠左下肢MEP amp较对照组大鼠缩短，具统计学意义(P<0.05)，实验组大鼠右下肢MEP amp与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠自身左右侧下肢MEP amp比较，左下肢MEP amp较右下肢缩短(P<0.01)。对照组大鼠自身左右侧比较无统计学意义(P>0.05)。③制模后3周，实验组大鼠左下肢MEP amp较对照组缩短(P<0.01)。实验组大鼠右下肢MEP amp与对照组大鼠右下肢比较无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠自身左右侧下肢TMS-MEP比较，左下肢MEP amp T较右下肢缩短(P<0.01)。对照组大鼠自身左右侧MEP amp比较无统计学意义(P>0.05)。④制模前、制模后1周、制模后3周实验组大鼠左下肢MEP amp三个时间点两两比较均具统计学意义：MEP amp逐渐缩短(P<0.01)。右下肢MEP amp比较无统计学意义(P>0.05)。

    3  讨论

    上、下运动神经元和运动单位构成了MEPs的神经传导通路，MEPs的波幅能直接反映此通路的完整性以及上运动神经元细胞膜的兴奋特性，MEP波幅的大小反映了皮质的输出兴奋α-运动神经元的数目及其同步性，是反映α-运动神经元兴奋性的一个指标。

    Tremblay等［1］研究了10例PD病人的下肢运动诱发电位，发现波幅显著增加，Bhatia M等［2］研究了19例PD患者的运动诱发电位，结果发现波幅与正常对照组相比无统计学意义。MEP波幅受众多因素的影响［3］:（1）刺激瞬间皮层运动神经元和前角细胞之间复杂的交互反应。（2）个体间的差异，而且这种差异大多难以或不能控制。（3）易化反映的影响。（4）下行冲动的影响。（5）焦虑及药物的影响。所以，临床上对PD患者的研究很难达到病人条件的一致性，这也可能是上述学者的研究结果不一致的原因。本研究显示PD模型大鼠损毁侧的对侧下肢TMS-MEP波幅增高，表明PD模型大鼠损毁侧对侧下肢运动通路的完整性受到破坏。波幅增加反映了损毁侧对侧下肢的大脑皮质兴奋性增加，导致皮质脊髓输出增加，α-运动神经元的兴奋性增加，而α-运动神经元在肌张力的维持中起主要作用，故临床上PD病人表现为强直症状。推测 PD模型大鼠的TMS-MEP的变化可能与以下因素有关：基底节区运动皮层输入环路紊乱, 导致运动皮质的兴奋性增加，故有静息阈值的降低，皮质脊髓束冲动传出增加，α前角细胞过度兴奋，故有波幅的增加。基底核多巴胺递质的缺乏可能影响前额叶运动区间联系的方式［4］，大脑皮层运动区（4区）对多巴胺的调节很敏感，皮层或皮层下多巴胺能的传递缺乏导致皮层抑制机制［5］, PD模型大鼠由于损毁侧皮质抑制机制的受损，兴奋和抑制之间的平衡失调，兴奋性相对的增加，皮质运动神经元异常活化，导致大脑皮质4区部分运动神经元过度“点燃”，皮质－脊髓系统冲动传出增加，导致靶肌肉兴奋前其活化水平增加，使α-运动神经元的兴奋性增加，表现为波幅增高。

    本研究发现术前实验组大鼠与对照组大鼠波幅比较无显著性差异，大鼠的运动诱发电位波幅术前即存在明显的个体差异，最小值为1.03 mv，最大值为4.45 mv，同一大鼠在相同刺激条件下MEP波形稳定, 左右侧波幅基本一致，不同大鼠之间即使刺激强度相同，MEP波幅仍有明显差异，因此运动诱发电位波幅是一个相对不敏感的参数，因其变化范围大，甚至正常人也如此，故它常作为参考指标［3］。但同一个体自体双侧波幅无明显差别，故自体双侧波幅比较较不同个体间波幅比较更有意义。表  制模前、制模后1周、制模后3周实验俎与对照组及实验俎自身双下肢运动诱发电位波幅的比较★:P<0.05，★★:P<0.01。

【参考文献】
  ［1］ Tremblay F, Tremblay LE.Cortico-motor excitability of the lower limb motor representation: a comparative study in Parkinson's disease and healthy controls. Clin Neurophysiol. 2002,113(12):2006-12.

［2］ Bhatia M, Johri S, Behari M.Increased cortical excitability with longer duration of Parkinson's disease as evaluated by transcranial magnetic stimulation. Neurology India.2003, 51(1):13-15.

［3］ 潘映辐主编，临床诱发电位学.北京:人民卫生出版社,2000,5(2):518.

［4］ Mir P, Matsunaga K,Gilio F,et al. Dopaminergic drugs restore facilitatory premotor-motor interactions in Parkinson disease.Neurology 2005,64(11):1906-12.

［5］ Cantello R, Tarletti R, Civardi C. Transcranial magnetic stimulation and Parkinson's disease. Brain Res Rev. 2002, 38(3):309-27.

作者单位：内蒙古医学院附属医院神经内科，内蒙古