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【摘要】 目的：研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的产酶及耐药模式，并对9种抗菌药做药敏试验，比较产酶菌与非产酶菌对9种抗菌药的耐药率，为临床治疗产酶菌感染提供理论依据。方法：菌株来源于2005年1月～2007年5月我院呼吸科住院患者送检合格痰标本中分离的大肠埃希菌43株、肺炎克雷伯菌67株。应用头孢西丁三维试验检测 AmpC酶，采用美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）表型筛选和确认试验检测ESBLs菌株，以K-B琼脂扩散法做药敏试验。结果：在110株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，6株（5.45%）产AmpC酶，20株（18.2%）产ESBLs，1株（0.90%）同时产AmpC酶和ESBLs。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶检出率分别为6.98%、5.97%，ESBLs检出率分别为16.3%、20.9%。产酶株对亚胺培南、头孢吡肟、阿米卡星耐药率低。结论：产AmpC酶和产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为多重耐药菌株，治疗产2种β内酰胺酶细菌引起的感染亚胺培南为首选，头孢吡肟和阿米卡星可作为选用药物之一。
【关键词】 AmpC酶；超广谱酶β内酰胺酶（ESBLs）；大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌；药敏试验
Detection of extended spectrum β lactamases and AmpCenzyme from escherichia coli and klebsiella pneumoniae
ZHU Yu-mei,WANG Yu
(The fifth people's hospital of Shengyang,Shengyang 110023,China;Department of Emergency of the Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University)
【Abstract】 Objective:To study the drug-resistance of enzymes-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae,compare the resistance rate of enzymes-producing strains and non- enzymes-producing strains to 9 antibiotics for the basis of treating infection caused by enzymes-producing strains.Methods:A total of 110 strains were isolated from the patients hospitalized in our respiratory ward during January 2005-May 2007, 43 strains of them were Escherichia coli, 67 strains of them were Klebsiella pneumoniae. A cefoxitin three-dimensional test and E-test were used to detect AmpC enzyme and extended spectrum β lactamases(ESBLs) respectively. Simultaneously, drug-susceptibility were meastured by disk diffusion method.Results:6(5.45%) strains was AmpC positive, 22(18.2%) strains was ESBLS positive and 1(0.90%) strains AmpC+ESBLs were found among 110 strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.The resistance rate of enzymes-producing strains were low to imipenem, cepepime and amikacin.Conclusion: Producing AmpC and ESBLs Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were multidrug-resistance strains. Imipenem was the most effective antibiotic for the treatment of infection caused by ESBLs or AmpC producing strains. Cepepime and amikacin were also effective for the treatment of such infections.
【Key words】 AmpC;ESBLs;Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae;Susceptibility-test
大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌都具有容纳外源性遗传物质的特性，作为医院感染的重要致病菌，继超广谱β内酰胺酶（ESBLs）后，又出现质粒介导的AmpC酶，其耐药问题日益复杂，往往导致抗感染治疗的失败［1，2］。本文对我院呼吸科2005年1月～2007年5月临床送检合格痰标本中分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共110株，检测其产酶及药敏情况，为临床治疗产β内酰胺酶菌株引起的感染提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 2005年1月～2007年5月我院呼吸科住院患者送检合格痰标本中分离的大肠埃希菌43株、肺炎克雷伯菌67株。
1.2 细菌鉴定方法
1.2.1 菌种鉴定采用法国API鉴定系统。抗生素敏感性测定采用纸片扩散法,判定依据美国NCCLS 2002年标准。
1.2.2 ESBLs的检测 ①筛选试验：依据NCCLS 2002年标准，抑菌环直径头孢他啶≤22mm，头孢曲松≤25mm，氨曲南或头孢噻肟≤27mm，至少符合两项指标高度怀疑ESBLs菌株。②确定试验：采用Etest方法，如果头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸对耐药菌MIC值≥8，即认定耐药菌产生了ESBLs。
1.2.3 AmpC酶的检测 ①筛选试验：采用头孢西丁纸片药敏试验（K-B法），将抑菌环直径头孢西丁≤14mm，头孢他啶≤18mm或/和头孢噻肟≤22mm者初筛为AmpC酶。②确定试验：β内酰胺酶的提取：将1～2个菌落接种至12ml胰蛋白胨大豆胨肉汤中，放入35℃恒温摇床中，200r/min孵育6h，离心集菌，反复冻溶5次后，用pH=7.0 PBS冲洗，4℃ 12 000r/min离心60min，取部分上清液经M-H琼脂平板常规细菌培养阴性后-20℃保存。头孢西丁三维试验：将大肠埃希菌ATCC25922制成浊度为0.5麦氏单位的菌悬液，用棉棒均匀涂布于MH平板上，在平皿中央帖一头孢西丁纸片，从距离纸片边缘5处用刀片向外（离心方向）切一裂隙，在此裂隙中加入40μl待测菌株β内酰胺酶粗提液，35℃过夜培养，若裂隙与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区，则提示产 AmpC酶［3］。
1.3 药品来源 ①药敏纸片由北京天坛生物制品有限公司提供。②MH培养基、胰蛋白胨大豆胨肉汤由英国Oxoid公司提供。③Etest试条为瑞典ABbiodisk公司提供。
1.4 统计学处理 将药敏结果中所有产酶株菌与非产酶菌的耐药率进行χ2检验，P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 110株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，分别检出单产AmpC酶、同时产AmpC酶和ESBLs和单产ESBLs细菌6株、1株、20株，总检出率分别为5.45%、0.90%、18.2%。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶检出率分别为6.98%、5.97%；ESBLs检出率分别为16.3%、20.9%。见表1。
表1 产AmpC酶和 ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌株数及检出率（略）
2.2 9种抗菌药对110株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏试验，结果见表2。将产酶株组与非产酶株组分别进行统计分析，产酶株组对三代头孢中头孢他啶、头孢噻肟及氨曲南耐药率高于非产酶株组，有非常显著差异（P<0.01）。产酶株组对环丙沙星耐药率亦高于非产酶株组，有显著差异（P<0.05）。阿米卡星、亚胺培南、头孢吡肟对产酶菌与非产酶菌耐药率均较低，差异无显著性（P＞0.05）。
表2 产酶菌与非产酶菌对9种抗菌药的耐药率（%）比较（略）
注：P值为所有产酶菌与非产酶菌耐药率的比较
3 讨论
AmpC酶由ampC基因编码产生，ampC基因的表达同时受ampR、ampD、ampE 以及 ampG等多种基因调控。ampC基因通常位于肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙雷菌属及假单胞菌属的染色体上，通过不同基因转移方式转至大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的质粒上，并随细菌复制而编码产生AmpC酶，导致大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素和酶抑制剂的耐药。本文结果显示，ESBLs仍是介导大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗菌药耐药的主要因素，但AmpC酶的存在增加了细菌对抗菌药耐药的复杂性及细菌横向传播的能力［4］。
将产酶株组与非产酶株组分别进行统计分析，产酶株组对三代头孢中头孢他啶、头孢噻肟及氨曲南耐药率高于非产酶株组。而头孢他啶无论对产ESBLs菌株还是非产酶菌，其耐药率均低于其他三代头孢菌素和氨曲南。但根据NCCLS的标准，只要确认为产ESBLs菌，不管药敏结果显示耐药还是敏感，均应报告对所有头孢菌素和氨曲南耐药。质粒介导的AmpC酶和ESBLs常与其他耐药基因相关联，表现为多重耐药，本结果也证实这一点。产酶株组对环丙沙星耐药率高于非产酶株组。阿米卡星属氨基糖甙类，产酶菌与非产酶菌耐药率无显著差异。产酶菌与非产酶菌对碳青霉烯类亚胺培南及四代头孢菌素头孢吡肟的耐药率均较低，未发现对亚胺培南耐药的产酶株。由于亚胺培南对β内酰胺酶具有高度稳定性，与所有革兰阴性菌的青霉素结合蛋白（PBPs）具有较高的亲和力，特别是PBP2，同时，亚胺培南极易进入细菌微孔蛋白D2通道，从而显示强大的抗菌活性。治疗AmpC酶和ESBLs引起的危重感染，应首选碳青霉烯类亚胺培南，第四代头孢菌素头孢吡肟对产AmpC酶的细菌感染有良好作用，但对产ESBLs菌则较差。而含有酶抑制剂的舒普深、特治星可作为产ESBLs菌株的选用药物之一。
随着越来越多的新型抗菌药应用于临床，细菌也不断通过耐药性逃避厄运。耐药性是细菌针对抗菌药应用造成选择性压力而进化的必然结果［5］。所以，控制质粒AmpC酶和ESBLs的耐药性和传播不能单纯寄希望于开发和研制新型抗生素，临床实践中尤其要注意掌握用药适应证，合理应用抗菌药，加强细菌耐药性监测及医院的严格消毒隔离制度。
【参考文献】
［1］ Deshpande LM, Jones RN,Fritsche TR,et al.Occurrence of plasmidic AmpC type beta-lactamase-mediated resistance in Escherichia coli:report from the sentry Antimicrobial Surveillance Program［J］.Int J Antimicrob Agents,2006，28:578-581.
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［3］ Black TA,Moland ES,Thomsoa KS.AmpC disk test for detection of plasmid-mediated βlactamases in Enterobacteriaceae lacking chromosomal AmpCβlactamases［J］.J Clin Microbiol,2005，43:3110-3113.
［4］ Philip ED,Nancy DH,Michael WC.Occurrence of extended-spectrumβ-lactamases and AmpC β-lactamases in bloodstream isolates of Klebsiella pneumonia :isolates harbor plasmid-mediated FOX-5 and ACT-1 AmpC β-lactamases［J］.J Clin Micro,2003，41:2772-2777.
［5］ Babic M,Hujer AM, Bonomo RA.What's new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases［J］.Drug Resist Updat,2006，9:142-156.
作者单位：沈阳市第五人民医院，辽宁 沈阳 110023；中国医科大学附属盛京医院急诊科