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【摘要】 目的：验证他莫昔芬(TAM)和顺铂(DDP)两种药物联合应用抑制人卵巢癌细胞HO-8910增殖作用的有效性，为卵巢癌的内分泌治疗和化学治疗联合应用提供理论依据。方法：以体外培养的HO-8910细胞为研究对象，不同剂量的TAM和DDP联合作用于HO-8910细胞， MTT法检测细胞生长抑制率；免疫组化SP法检测PCNA在细胞中的表达；流式细胞仪PI染色法分析细胞周期分布的改变，并用AV-PI双染色法检测TAM联合DDP对细胞凋亡的影响。结果：TAM和DDP联合用药组与阳性对照组相比，大剂量TAM合用不同剂量的DDP组及中剂量TAM合用大剂量DDP(3.3μmol/L)组，细胞生长抑制率有显著性差异(P＜0.05)；TAM浓度≥1.0μmol/L合用不同剂量的DDP时PCNA表达阳性率有显著性差异(P＜0.05)；TAM使G1期细胞抑制，DDP作用于G1期细胞，G1期减少，细胞阻滞于S期；TAM和DDP联合应用时随着药物浓度增加凋亡指数逐渐增大。联合用药组组间比较，大剂量TAM合用小剂量DDP（1.7μmol/L）组与中剂量TAM合用大剂量DDP（3.3μmol/L）组间细胞生长抑制率及PCNA表达阳性率无显著性差异（P>0.05）。结论：TAM和DDP联合用药可有效抑制人卵巢癌细胞HO-8910细胞生长及增殖。
【关键词】 他莫昔芬；顺铂；卵巢癌细胞；增殖；细胞周期
Tamoxifen combined with cisplatin suppress the proliferation of human ovarian cancer cell line HO-8910 in vitro
ZHAO Ying，CHEN Yan-hua
（Department of Obstetrics and Gynecology in Red Cross Hospital in Shenyang City，liaoning 110033，China）
【Abstract】 Purpose:To investigate the effect of tamoxifen combined with cisplatin on the growth of human ovarian cancer cell,and to insepect the efficacy that TAM combined with DDP suppressed the growth and proliferation of the cell HO-8910 so as to provide theoretical evidence of the combination with endocrine therapy and chemotherapy.Methods:Human ovarian cancer cell line HO-8910 was studied.Different doses of TAM and DDP were combined in human ovarian cancer cell line HO-8910.The growth inhibition ratio of the cell was detected with MTT,the expression of Prolifering cell nuclear antigen(PCNA) in HO-8910 was detected with immunohistochemical stining SP method,the cell cycle changes was analyzed by PI coloration of flow cytometry and cell apoptosis index was analyzed by AV-PI coloration of flow cytometry.Results:Compared with positive control group,the experimental groups of high-dose TAM combined with different dose of DDP and the experimental group of intermedial dose TAM combined with high-dose DDP(3.3μmol/L) had significant difference in the growth inhibition ratio of the cell(P＜0.05);TAM(≥1.0μmol/L) combined with different dose of DDP had significant difference in the expression of PCNA(P＜0.05);the most prominent effect of TAM on cell cycle kinetics was aslowdown in G1-phase transit and DDP induced S-phase arrest; following the increase of doses of TAM and DPP apoptotic index increased by degrees.Compared with the groups of drug combination,it was the experimental group of high-dose TAM combined with low-dose DDP(1.7μmol/L) and the group of intermedial dose TAM combined with high-dose DDP (3.3μmol/L) that had significant difference in the growth inhibition ratio of the cell and the expression of PCNA.Conclusion:TAM combined with DDP suppressed the growth and proliferation of the cell HO-8910 efficiently.
【Key words】 Tamoxifen;Cisplatin;Human ovarian cancer;Proliferation;Cell cycle
卵巢癌是较常见的妇科恶性肿瘤之一，卵巢癌有内分泌治疗的物质基础［1］。内分泌治疗有毒性低的特点，而且内分泌治疗药物可给予任何年龄，而且不受治疗阶段的限制。然而，内分泌治疗和化疗联合治疗应用的标准化方案可否成为第一线治疗方案，还有待进一步研究探讨。本研究用不同剂量的他莫昔芬(TAM)和顺铂(DDP)联合作用于人卵巢癌非耐药细胞株HO-8910，观察两药联合应用对肿瘤细胞生长及增殖的抑制作用，为卵巢癌的内分泌治疗与化学治疗联合应用提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 人卵巢癌细胞系HO-8910：中科院上海细胞库；TAM：美国Sigma公司；DDP：云南个旧生物药业有限公司；RPMI1640培养基：美国Gibco公司；MTT：北京华美生物工程公司；PCNA免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；PI单染试剂盒及AV-PI双染试剂盒：北京宝塞生物技术有限公司;流式细胞仪：美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞处理 按文献［2］的方法培养细胞，倒置显微镜下观察细胞生长情况，取对数生长期细胞进行实验。接种细胞并调整细胞密度。加入药物：TAM终浓度0.1、1.0、5.0μmol/L，顺铂终浓度是药物血浆峰浓度［3］的1/6、1/3，即是1.7、3.3mol/L（即0.5、1.0mg/L）。显微镜下观察加药后细胞生长情况。于24小时后将培养瓶中的细胞经消化、洗涤、离心，制成单细胞悬液，做细胞凋亡及周期分布检测。于48小时后作活细胞计数及PCNA的检测。实验至少重复两次。实验分组：空白对照组、阳性对照组、联合用药组。
1.2.2 MTT法检测细胞抑制率 取上述培养96孔板，每孔中加入终浓度为5mg/ml的MTT 100μl，培育4h。吸出培养液，加入等量（100μl）二甲基亚砜振荡10分钟，使其充分溶解，然后在分光光度计下于570nm处测定吸光度A值。按照如下公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(空白对照组A值－用药组A值)/空白对照组A值×100％。
1.2.3 免疫组化检测PCNA表达 用SP法将实验组和对照组的细胞分别制成细胞涂片，按照免疫组化说明书分别加入一抗和二抗，DAB显色、复染、封片，显微镜下检查，PCNA阳性细胞为细胞核着色呈棕黄色，记数500个细胞内的阳性细胞，求出其阳性百分数。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡指数 取上述培养的培养瓶，制单细胞悬液，调整细胞密度。取1ml细胞，离心、PBS液洗，再离心，冷乙醇固定，用PBS液洗去乙醇，离心，留约l00μl液体重悬。之后按照PI染色及AV-PI双染色法将细胞分别重悬于200μlRNaseA（1mg/ml）、800μl PI染色液和200μl Binding Buffer、10μl Annexin V-FITC和5μl PI，37℃水浴30分钟，混匀，避光。上机检测。
1.3 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件对计量资料进行方差分析，用LSD法进行组内及组间两两比较；实验数据用均数±标准差（±s）表示。
2 结果
2.1 细胞生长抑制率 TAM联合DDP作用于人卵巢癌细胞HO-8910 48h后细胞生长抑制率见表1。吸光度F=40.322，抑制率F=25.478。抑制率公式：抑制率(%)＝
空白对照组A值-用药组A值空白对照组A值×100%。阳性对照组比较：*表示P＜0.05；联合用药组组间比较：2、4组间，3、5组间无显著性差异（P分别为0.904、0.292，P＞0.05），其余各组间比较均有显著性差异（P＜0.05）。
表1 MTT法检测细胞生长抑制率结果（略）
2.2 PCNA表达 见表2。F=216.024，对照组比较：P＜0.05用*表示。联合用药组组间比较：3、5组间的无显著性差异（P＝0.175＞0.05），其余各组间比较均有显著性差异（P＜0.05）。
表2 免疫组化SP法检测PCNA阳性率（略）
2.3 细胞凋亡指数及细胞周期分布 见表3。由表3可知，当DDP浓度相同时，随着TAM浓度增加，G1细胞有增多趋势，TAM使细胞阻滞于G1期；当TAM浓度相同时，随着DDP浓度增加，G1细胞减少、S期细胞增多，DDP作用于G1期细胞，G1期细胞减少，细胞阻滞于S期。两药联合应用时，S期细胞明显减少，G1期细胞增多，G2期细胞无明显变化。DDP浓度是1.7μmol/L时，使TAM发挥较好的作用。TAM和DDP联合应用时随着药物浓度增加凋亡指数增大。
表3 细胞周期分布及细胞凋亡指数（略）
3 讨论
3.1 TAM联合DDP抑制人卵巢癌细胞增殖的有效性
3.1.1 MTT法检测细胞生长抑制率 MTT法根据活细胞线粒体有活性的酶可使MTT还原为甲瓒的原理，用扫描分光光度计测定甲瓒的含量，推测活细胞数量。当肿瘤细胞被杀灭后，产生的甲瓒量减少，减少的程度反映体外药敏情况［4］。美国国立癌症研究所已将MTT法纳入抗癌药物筛选程序。由表1可知，两药联合应用明显抑制卵巢癌细胞的生长。同时，验证了TAM和DDP对肿瘤细胞生长的抑制作用有剂量依赖性，与陈红等［5］人报道相一致。
3.1.2 PCNA表达 PCNA是一种仅在增殖细胞中合成与表达的多肽，与细胞的增殖周期有关。肿瘤细胞的增殖是决定肿瘤细胞生物学行为的重要参数。近几年，PCNA被证实是一种很好的判断细胞增殖状况的标记，可用于肿瘤的诊断，指导治疗及预后评估。一般认为，用药后PCNA阳性表达越少，说明药物疗效越好［6］。表2说明，两药联合应用具有抗卵巢癌细胞增殖的作用。宋文月等［7］人研究报道，小剂量TAM(≤1.0μmol/L)对PCNA的表达无影响。而本实验结果提示，当TAM的剂量为1.0μmol/L可影响PCNA的表达，从而推论TAM和DDP联合应用可起到抗人卵巢癌细胞增殖的作用。这与McClay等［8］人的TAM和DDP联合应用增加细胞毒作用的研究相一致。
3.2 TAM联合DDP抑制卵巢癌细胞增殖的机制探讨 目前认为，他莫昔芬治疗卵巢癌有一定的短期疗效，但不能充分肯定，仅用于卵巢癌手术及化疗的辅助治疗、复发癌再治疗或耐药病例的姑息治疗［9］。研究发现，他莫昔芬作为卵巢癌内分泌治疗的常用药物之一， 其作用机制：①抗雌激素作用。②细胞毒作用。③通过TAM及其代谢产物抑制estrone（雌酮）转变为雌二醇并抑制蛋白激酶C（PKC）或钙调蛋白的表达发挥作用［9］。④通过P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)等逆转耐药［10，11］。⑤增加化疗药物敏感性［12，13］。另外，TAM还通过参与凋亡相关基因的调控［14］、抑制MAPK信号传导通路［15］等方式起到抗肿瘤作用。顺铂是铂的金属铂合物，其主要作用靶点为DNA，使DNA模板作用失活，从而抑制DNA的合成、破坏其复制而发挥细胞毒作用［16，17］。DDP还可以通过诱导肿瘤细胞凋亡［18］、参与肿瘤细胞信号传导等方式抑制肿瘤细胞生长。TAM和DDP抗肿瘤机制不同，而且均可诱导肿瘤细胞凋亡，因此，理论上讲两药联合应用有增强疗效的可能。临床研究表明，TAM和DDP联合应用治疗卵巢癌是否有效是有争议的问题。Markman等［19］人研究结果并不能证明两者联合应用治疗铂类耐药的卵巢癌患者效果更好。但是，Panici等［20］研究结果提示TAM与铂类联合对顺铂耐药的晚期卵巢癌有效，由于其毒副反应轻、花费低，值得进一步研究。本实验证实了两药联用是有意义的。与Panici等临床试验研究结果相一致。
有学者认为，多种化疗药物可以引起肿瘤细胞特定靶成分的损伤或功能丧失，从而传递信号引起细胞周期阻滞及进入细胞凋亡［21］。Ercoli等［22］对TAM诱导卵巢癌细胞凋亡的研究结果表明，10-6mol／L TAM对ER阴性卵巢癌细胞系A2780作用后出现明显G1期阻滞，细胞增殖率降低，电泳表现典型的梯形条带。本研究显示，TAM使细胞阻止于G0/G1期，使细胞不能通过G1/S限制点进入S期进行复制，使S期细胞减少，DNA合成受抑制。而DDP对G1期细胞敏感，使G1期细胞减少，细胞阻滞于S 期。两种药物合用时，S期细胞明显减少、G1期细胞增多、G2期细胞无明显变化。TAM和DDP作用于细胞周期的不同时相，可能是两药联合应用抑制卵巢癌细胞增殖的作用基础。流式细胞仪检测细胞凋亡指数，显示随着药物剂量的增加凋亡指数增大。TAM和DDP联合应用抑制细胞生长，与诱导细胞凋亡有关。
基础研究发现，在雌激素依赖性肿瘤细胞（卵巢肿瘤、乳腺肿瘤等）中存在雌激素受体信号通路与PI3K信号转导通路的相互作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂RAD001和TAM联合应用于人卵巢癌细胞，两者合用明显抑制细胞生长［23］。Arimoto-Ishida 等［24］人研究发现，顺铂通过抑制PI3K或者Akt级联反应引起FKHRL1（forkhead家族转录因子即DNA叉头转录因子）磷酸化，从而使卵巢癌细胞对顺铂敏感。因此可以假设，TAM 和DDP联合应用抑制卵巢癌细胞生长，可能是与PI3K途径有关，还有待进一步实验研究证实。
TAM和DDP联合应用于人卵巢癌细胞HO-8910，可有效抑制肿瘤细胞生长及增殖，可能与调节细胞周期分布、参与PI3K途径有关，从而为卵巢癌的内分泌治疗和化学治疗联合应用提供实验基础。TAM和DDP联合应用最为合适的配比剂量及两药联用抑制肿瘤细胞增殖与肿瘤细胞信号转导通路、凋亡相关蛋白、抗癌基因等相关性问题还有待进一步实验研究。
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作者单位：沈阳市红十字会医院妇产科，辽宁 沈阳 110033