卵巢癌细胞凋亡的体外药敏研究

　　【摘要】 目的  以人卵巢癌细胞系HO-8910为对象，以人黑色素瘤细胞株A-375为阳性对照，以细胞抑制率、细胞凋亡为指标，评价8种化疗药物在体外诱导卵巢癌细胞凋亡效应，为临床卵巢癌患者个体性化疗提供实验依据。 方法  （1）应用MTT法检测8种化疗药物对卵巢癌细胞系HO-8910细胞和对照组不同时间、不同浓度化疗药物及其组合的细胞抑制率进行对比，筛选出抑制率最高的化疗药物并进行组合;（2）通过FCM法检测其诱导细胞凋亡的效果，采用Annexin-V-FITC结合碘化丙啶（PI）染色和TdT介导X-dUTP缺口末端标记（TUNEL）。 结果  （1）在MTT法定量检测中，8种化疗药物作用48h对HO-8910细胞系生长抑制率与对照组相比具有不同程度的差异性，其中以4PPC（32μg/ml）的CDDP与4PPC（0.12μg/ml）的As 2 O 3 效果最显著，此时HO-8910细胞系的细胞抑制率分别为80.43%和73.37%，与对照组比较，差异有显著性（P=0.01）;4PPC（216μg/ml）的紫杉醇、1/2PPC（80μg/ml）的5-FU对HO-8910细胞系的生长抑制率分别为70.45%和88.95%，与对照组比较，差异无显著性（P>0.05）;4PPC（0.544μg/ml）的奥沙利铂、2PPC（26μg/ml）的MTX、4PPC（0.12μg/ml）的VCR对HO-8910细胞系的生长抑制率分别为69.52%、71.88%和68.63%，与对照组比较，差异无显著性（P>0.05）;BLM对HO-8910细胞系生长无抑制作用;（2）FCM法定量检测CDDP+BLM+紫杉醇化疗药物组合作用2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h9个时间段对HO-8910细胞系的细胞凋亡率，与空白对照组比较具有不同程度的差异性，其中以作用48h的细胞凋亡率最高（75.70%），差异有显著性（P=0.0136）。 结论  （1）卵巢癌细胞的化疗敏感性与化疗药诱导的卵巢癌细胞凋亡密切相关;（2）细胞抑制率、早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡、细胞凋亡率可作为制定卵巢癌个体性治疗方案的评价指数体系;（3）在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物，再通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案，这一肿瘤个体性化疗方案制定程序具有可行性，为卵巢癌者个体性化疗方案的制定提供了一个有用的研究模式。
    
　　关键词  卵巢癌 细胞凋亡 体外 药敏实验 MTT法 FCM法
      
　　Chemosensitivity of ovarian cancer cell lines apoptosis in vitro
     
　　Liu Yi
    
　　Department of Obstetrics and Gynecology，Zunyi Medical College，Zunyi563000.
   
　　【Abstract】 Objective To study the characteristics of the ovarian cancer cell lines HO-8910apoptosis which is induced by chemotherapy drugs and the relationship between the ovarian cancer chemosensitivity.Methods （1）By using MTT test methods gets the growth inhibition precence of ovarian cancer cell lines HO-8910，so we can pri-marily choose the best chemotherapy drugs and their corporations.They can be used as the foundation of the FCMtest methods.（2）Through the FCM test methods of binding the Annexin-V-FITC with PI and TUNEL kit，can test the ovarian cancer cells'earlier apoptosis percence and later ones of the different time and different dose of chemotherapy drugs and their corporations.Then can analyze and make the ovarian cancer cell lines HO-8910's apoptosis chart，so get the chemosensitivity lines to the cell lines uniquely.Results （1）In the MTT test methods，the ovarian cancer cell lines HO-8910has all levels different responses to the8chemotherapy drugs verus human blake tumor cell lines.（2）In the FCM test methods，the corporation of CDDP+Taxol+BLM has the best apoptosis，contrasting to the blank control has conspicous difference（P<0.05）.Conclusion （1）The ovarian cancer chemosensitivity has closely correlation with the apoptosis of ovarian cancer.（2）The in vitro chemosensitivity experiment of apoptosis has made reference index for preclinical test of the ovarian cancer in vitro chemosensitivity experiment.
   
　　Key words ovarian carcinoma apoptosis in vitro chemosensitivity experiment MTT test methods flow cytometric test methods
      
　　卵巢癌具有恶性度高、易复发、易产生多药耐药的特性，患者5年生存率一直徘徊在20%～30%之间 ［1］ 。近年来，随着细胞凋亡研究的深入，发现细胞凋亡阻抑是卵巢癌产生多药耐药现象的直接原因 ［2］ 。

　　1 材料与方法
   
　　1.1 肿瘤细胞系 HO-8910细胞系购于中国科学院上海细胞库，人黑色素瘤细胞株A-375由遵医附院皮肤科教研室赠送。
   
　　1.2 药品、试剂及配制方法
   
　　1.2.1 所需药品、试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基购于GIBICO公司，MTT试剂、DMSO购于SIGMA公司，Annexin-V-FITC流式细胞试剂盒（BD BIOSCIENCE Pharmingen，型号556547/6693KK）、TUNEL法的流式细胞试剂盒APO-DI-RETM KIT（ALEXIS BIOCHEMCALS，型号850-041-K101）均购于深圳晶美试剂公司，化疗药物BLM、奥沙利铂、CD-DP、紫杉醇、5-FU、MTX、VCR、As 2 O 3 均购于遵医附院药剂科，胰蛋白酶1∶250购于北京华美试剂公司。
   
　　1.2.2 细胞合成培养液的配制与灭菌 见《细胞培养的基本原理及技术》。
   
　　1.2.3 0.25%胰蛋白酶溶液的配制与灭菌 见《细胞培养的基本原理及技术》。
   
　　1.2.4 化疗药物的配制 配制BLM、奥沙利铂、CDDP、紫杉醇、5-FU、MTX、VCR、As 2 O 3 8种化疗药物的工作浓度，参照体外药敏实验相关文献中化疗药物工作浓度的选择，以PPC作为药物工作浓度的基础，用生理盐水配制成50PPC的母液，置于-20℃冰箱中保存 ［1］ 。（1）计算8种药物的PPC［PPC（μg/ml）=50×D（mg/kg）/5000×2×103］ ［2］ 。①BLM:PPC=0.192μg/ml;②奥沙利铂:PPC=0.136μg/ml;③CDDP:PPC=8μg/ml;④紫杉醇PPC=54μg/ml;⑤5-FU:PPC=160μg/ml;⑥MTX:PPC=13μg/ml;⑦VCR:PPC=0.03μg/ml;⑧As 2 O 3 :PPC=0.3μg/ml。（2）配制8种化疗药物的工作浓度:从冰箱中解冻配制的母液，用合成培养液将其稀释琢1/4、1/2、1、4、10、20倍PPC。
   
　　1.3 主要仪器 CO 2 培养箱（国产），TCAN酶标荧光仪，流式细胞仪（FACSCalibur台式机）。
　　
　　1.4 实验分组
   
　　1.4.1 MTT法的分组 处于指数生长期的HO-8910细胞、人黑色素瘤细胞未用药组为对照组;处于指数生长期的HO-8910细胞、人黑色素瘤细胞用药组为实验组。
   
　　1.4.2 FCM法的分组 处于指数生长期的HO-8910细胞未用药组为对照组;处于指数生长期的HO-8910细胞用药组为实验组。

　　1.5 实验步骤
   
　　1.5.1 HO-8910细胞系传代培养和生长周期的观测 （1）收集细胞:将进入指数生长期的细胞用酶消化法收集到另一无菌培养瓶中;（2）将收集到的细胞悬液，细胞同步化生长;（3）每隔24h，取出24孔细胞培养板在超净台上，用酶消化法收集3孔内细胞，分别计数每孔内细胞密度（每孔计数3次，取其平均值），再计数3孔细胞密度，取其平均值，得到细胞生长曲线上第1个标记点。依次得到细胞生长曲线上11个标记点，绘制出HO-8910细胞在本实验室条件下的细胞生长曲线。
   
　　1.5.2 抗癌药对HO-8910细胞的抑制效应实验 见MTT法。
   
　　1.5.3 抗癌药诱导HO-8910细胞凋亡实验 见FCM法。

　　1.6 评价指标及方法
   
　　1.6.1 细胞抑制率 （1）本课题采用MTT法作为细胞抑制率检测方法。（2）MTT法步骤:①弃去实验组含药物的培养液与对照组不含药物的培养液，每孔加入100μl D-Hank's液洗2次;②加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）培养液150μl放入CO 2 养箱内孵育24h，再加入MTT（5mg/ml）作用4h;③吸尽培养板中的上清液，每孔加入DMSO200μl，振荡10min，在自动免疫荧光仪上设定550nm和630nm的波长，分别测每孔吸光度值A1值和A2值，A1减A2即为每孔的A值，取其3孔求平均值，重复3次取平均值。（3）细 胞抑制率的计算及评价:细胞抑制率=（1-实验组平均光密度A值/对照组平均光密度A值）×100% ［3］ ，重复3次取其平均值，筛选出敏感的化疗药物。细胞生长抑制率:>70%为敏感;50%～70%为中度敏感;<50%为耐药 ［4］ 。
   
　　1.6.2 早期细胞凋亡 （1）FCM法结合FITC标记的An-nexin-V联合PI染色作为卵巢癌体外药敏实验的早期细胞凋亡检测方法。原理:根据Ca 2+ 依赖的磷脂结合蛋白Annexin-V能高亲和结合PS的原理 ［5］ ，Annexin-V作为检测细胞表面PS的敏感探针，用于细胞凋亡早期的检测。由于坏死细胞的细胞膜丧失其完整性，亦可能出现PS外翻，故同时使用膜非通透性DNA染料PI则能从Annexin-V染色的细胞中将凋亡和坏死细胞区别开来，即:Annexin-V（+）/PI（-）为凋亡细胞;Annexin-V（+）/PI（+）为坏死细胞。（2）Annexin-V-FITC+PI染色步骤及FCM检测:①用冷FBS液（pH7.4）洗细胞2次，然后用1×buffer重新悬浮细胞悬液使细胞密度为1×106个/ml;②吸取100μl上步骤制备的单细胞悬液至5ml流式孵育管内，每管加入Annexin-V-FITC5μl与PI染液5μl，轻轻振荡细胞后在室温避光孵育15min;③1h内向上步骤孵育后的管内每管加入400μl1×buffer并进行流式上样，采用Cell QUEST软件采集分析。

　　1.6.3 晚期细胞凋亡 （1）FCM法结合TUNEL的APO-DIRECT KIT作为卵巢癌体外药敏实验的晚期细胞凋亡检测方法。原理:晚期细胞凋亡时核酸内切酶激活，使DNA断裂成50～300kb的片段，最终降解成为180～200bp的片段，此时将经甲醛固定后的细胞加入外源性的TdT和X-dUTP孵育一定时间，通过TdT介导X-dUTP作为DNA断裂处3'-OH末端掺入的引物，并被X-dUTP所标记，再通过FCM的荧光标记FITC-dUTP，一步反应后即可经FCM检测DNA碎片，并可将凋亡细胞与坏死细胞区分开来。（2）TUNEL的APO-DIRECT KIT操作步骤FCM检测 ①细胞固定;②上样:FCM上样采用Cell QUEST软件进行采集分析。
   
　　1.6.4 细胞凋亡率（AP） AP=（凋亡细胞数/检测细胞总数）×100% ［6］ ，与对照组对比P<0.05，差异有显著性，化疗药以诱导HO-8910细胞凋亡为主。
   
　　1.7 统计学方法 采用SPSS11.5软件处理，进行χ 2 检验与t检验。

　　2 结果
    
　　2.1 HO-8910细胞系细胞生长曲线 见图1。
 
　　图1 HO-8910细胞在本室条件下的生长曲线（略）
   
　　由图1可见，细胞同步化后的HO-8910细胞系于培养的第2天进入指数生长期，第3～7天为指数生长阶段，第8天进入平台期，第9～11天为停滞期，其中第11天进入衰退期。每一代传代培养的细胞根据其生长变化的过程，可分为潜伏期、指数生长期和停滞期（包括平台期与衰退期）。指数生长期又称对数生长期，是细胞增生最活跃的阶段，研究证实多数化疗药物优先杀灭指数生长期细胞。故本课题取指数生长期细胞作为体外化疗敏感性研究检测的效应细 胞。
   
　　2.2 MTT法检测8种化疗药物对HO-8910细胞系的生长抑制作用 常规培养的HO-8910细胞系细胞抑制率为0。见表1。
    
　　表1 MTT法检测8种化疗药物对HO-8910细胞的抑制率 （略）
    
　　注: ★ P=0.01; ▲ P>0.05
    
　　2.3 抗癌药物组合作用不同时间诱导HO-8910细胞早期凋亡效应 在CDDP+BLM+紫杉醇化疗药物联合作用2h、4h、6h、8h、10h的HO-8910细胞的凋亡率与对照组比较，FCM的散点图见图2，数据统计见表2。从图2左下区看，诱导早期凋亡的效应依次为:B4h、B2h、B6h、B8h和B10h;由图2与表2得到结果如下:实验组的AP在CDDP+BLM+紫杉醇作用2～4h之间上升，在6h开始下降，8～10h之间迅速下降，而对照组的最高AP值在同等条件培养6h时，此后即迅速下降，故实验组与对照组的AP变化有差异，以4h时差异有显著性（P=0.0145）。
    
　　表2 CDDP+BLM+紫杉醇作用不同时间诱导HO-8910细胞早期凋亡效应 （略）
    
　　注: ※ P=0.0145
    
　　2.4 抗癌药物组合作用不同时间诱导HO-8910细胞晚期凋亡效应 HO-8910细胞在CDDP+BLM+紫杉醇作用12～48h之间细胞晚期凋亡率直线上升，与对照组比较具有差异，以48h时差异有显著性（P=0.0136），见图3。
 
　　图2 CDDP+BLM+紫杉醇作用不同时间诱导HO-8910细胞早期凋亡散点图（略）
   
　　注:每幅图的左上区代表完全坏死的细胞PI（+）;左下区代表活细胞Annexin-V（-）/PI（-）;右上区代表坏死细胞和凋亡细胞Annexin-V（+）/PI（+）;右下区代表早期凋亡细胞Annexin-V（+）/PI（-）。A为相应时间的对照组，B2h～B10h为CDDP+BLM+紫杉醇不同时间诱导HO-8910细胞早期凋亡的效应
 
　　图3 CDDP+BLM+紫杉醇组合联合作用不同时间诱导HO-8910细胞的晚期凋亡组方图（略）
   
　　注:A代表相应时间的对照组，M2代表晚期凋亡细胞百分率的荧光道值;B12h～B24h为CDDP+BLM+紫杉醇不同时间诱导HO-8910细胞晚期凋亡的效应，由图3看，诱导晚期凋亡的效应依次为B48h、B24h和B12h
    
　　3 讨论

　　卵巢癌是目前妇科肿瘤中死亡率最高的疾病，化疗是其治疗的重要手段之一，但是由于临床化疗缺乏个体性，使得卵巢癌细胞对化疗药物产生的多药耐药性成为卵巢癌化疗失败的主要原因。卵巢癌的多药耐药性是化疗药诱导卵巢癌细胞凋亡受阻抑的结果，因此进行卵巢癌细胞凋亡的体外药敏研究成为卵巢癌患者个体性化疗的希望。本课题以人卵巢癌细胞系为生物模式，选择临床常用的8种抗癌药物，采用MTT法以及FCM法分别检测细胞抑制率和细胞凋亡率，并以此作为人卵巢癌个体性化疗方案的指标体系和制定程序，旨在为卵巢癌患者个体性化疗方案的制定提供一个有效的研究模式。
   
　　3.1 MTT法检测结果的临床意义 MTT法检测结果显示4PPC的As 2 O 3 对HO-8910细胞的增殖具有明显的抑制作用，细胞抑制率为73.37%，与对照组比较，差异有显著性。本研究结果还发现，4PPC的紫杉醇的细胞抑制率虽然>70%，HO-8910细胞对其敏感，但与对照组比较，差异无显著性，并且低于4PPC的CDDP的抑制率，因此，本研究结果与临床疗效不吻合。这与卵巢癌细胞系对化疗药物存在选择性密切相关。此外，紫杉醇价格昂贵，缺乏大量临床样本的回顾性研究，这也可作为今后研究的新方向。
   
　　3.2 FCM法检测结果的临床意义 近5年来，设法诱导卵巢癌细胞凋亡已成为新的化疗目标，因此细胞凋亡程度成为评估疗效的一项新指标［7］ 。FCM法检测细胞凋亡具有敏感度高、特异性好的优点，因此，通过FCM法检测细胞凋亡成为卵巢癌体外药敏研究的热点。本课题与其他细胞凋亡的体外化疗敏感性实验设计相比，独特之处在于，在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物，再通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案。本研究结果发现，化疗药物组合CDDP+紫杉醇+BLM诱导早期细胞凋亡的效应依次为:4h、2h、6h、8h、10h。作用4h达最高AP值，为38.89%，与对照组比较差异有显著性（P=0.0145）;诱导晚期细胞凋亡的效应依次为:48h、24h、12h。作用48h达最高AP值（75.70%），与对照组比较，差异有显著性（P=0.0136）（未见相关文献报道）。该组合诱导HO-8910细胞系细胞凋亡的AP值呈Z型上升，其中晚期AP值直线上升，因此CD-DP+BLM+紫杉醇组合诱导早期细胞凋亡的时间为2～4h，此后即进入晚期凋亡，故CDDP+BLM+紫杉醇组合对HO-8910细胞系的作用以诱导细胞凋亡为主，并呈时间依赖性。与MTT法检测的该药物组合的细胞抑制率结合发现两者具有统一性，即CDDP+BLM+紫杉醇组合的细胞抑制率、细胞凋亡率均在作用48h最高。因此以MTT法检测的细胞抑制率为基础，筛选出抗癌药物组合，再通过FCM法检测的细胞凋亡率作为评价该组合方案的制定程序具有可行性，为卵巢癌患者个体性化疗方案的制定提供了一个有价值的研究模式。FCM法以流式细胞仪为检测平台，可同时进行多参数的定量检测 ［8］ ，由于流式细胞仪价格昂贵，技术指标复杂，使得FCM法还没有在临床上广泛开展。但其高特异性以及良好的敏感性将不断扩大FCM的使用范围。 4 结论 本研究采用相差显微镜观察法、MTT法以及FCM检测法，以人黑色素瘤细胞株作为对照组，对8种药物及其组合作用后卵巢癌细胞系HO-8910进行体外药敏研究。通过MTT法检测的8种药物及其组合作用后的细胞抑制率，筛选出的化疗药物组合进行FCM法检测该组合诱导HO-8910细胞凋亡的AP。结果揭示:（1）卵巢癌细胞的化疗敏感性与化疗药诱导的卵巢癌细胞凋亡密切相关;（2）细胞抑制率、早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡、细胞凋亡率可作为制定卵巢癌个体性治疗方案的评价指数体系;（3）在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物，再通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案，这一肿瘤个体性化疗方案制定程序具有可行性，为其他肿瘤患者个体化疗方案的制定提供了一个有效的研究模式。
    
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　　8 Kerr JFR，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phe-nomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.BR J Can-cer，1972，26:239.

　　（编辑苜 紫）

　　作者单位:563000贵州遵义医学院妇产科