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【摘要】 目的：探讨双相障碍与血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多态性之间的相关性。方法：按照《中国精神障碍分类和诊断标准》（CCMD-3）的双相障碍的诊断标准选择研究组64例、健康对照组100例；每例研究对象抽取静脉血提取DNA，应用聚合酶链式反应（PCR）及限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测ACE基因的I/D多态性，采用病例-对照的关联分析方法对基因型和等位基因频率进行分析。结果：研究组和对照组的ACE基因型符合Hardy-Weinberg平衡法则；两组间ACE基因型和等位基因频率分布均无显著性差异。结论：TPH基因型和等位基因频率分布与双相障碍无关联性。
【关键词】 双相障碍；ACE基因；基因多态性
Research of the polymorphisms of angiotensin-
converting enzyme gene in bipolar disorder patients
LIU Yu-ping，ZHENG Hong-bo,XIAO Ai-xiang,et al
(Guangzhou Psychiatric Hospital,Guangzhou 510665,China)
【Abstract】 Objective:To explore the association between I/D polymorphisms of the angiotensin-converting enzyme gene and bipolar disorder.Methods：64 patients were recruited according to the diagnosis criteria of bipolar disorder in CCMD-3,and 100 healthy persons in the control group; Venous blood was taken from all individuals into the ACD-containing tube. After DNA isolation, the ACE gene were determined by the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique.The case-control association analysis was adopted to analyze the frequencies of genotype and alleles between the patients and the healthy persons.Results：The values of the genotypes of the both groups consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium; The distribution of genotypes or alleles of ACE genes had no significant difference between the two groups(P>0.05).Conclusion：No association between the polymorphisms of ACE gene and the bipolar disorder.
【Key words】 Bipolar disorder;ACE gene;Polymorphism
双相情感障碍是一种以抑郁和躁狂交替发作的神经精神疾病,虽然目前这种疾病的病因学并不是很清楚,但是家族、孪生子和寄养子研究均有有力的证据表明该疾病具有明显的遗传易感性［1］。
目前，可能血管紧张素转换酶基因(ACE)在情感障碍的病例对照研究中是被报道得最为广泛的。Arinami曾报道，情感障碍与ACE的插入/缺失（I/D）多态性关联［2］。I/D多态性以ACE基因16内含子的287bpDNA存在或缺失为特征，其缺失与高水平的ACE相关。生化研究表明，ACE影响体内与情绪、行为或认知过程有关的血管紧张素Ⅱ和P物质的水平，而双相障碍的患者主要表现出情绪症状，也可能伴有行为或认知损害，所以猜测，ACE基因的I/D多态性可能与双相情感障碍存在关联。但是，目前这方面的研究结论并不统一,因为有病例对照研究也显示双相障碍患者ACE(I/D)变异的等位基因或基因型分布频率与对照组比较并无差异［3］。因此，本研究参照其他研究方法，进一步探讨双相障碍与ACE的I/D变异之间的关联性。
1 对象与方法
1.1 对象 研究组对象为2006年7月至2008 年5月来自广州市脑科医院门诊或住院部的患者，均符合《中国精神障碍分类和诊断标准》（CCMD-3）中双相障碍的诊断标准，汉族；对照组为无任何精神疾病或精神疾病家族史的健康对象。按照CCMD-3诊断标准两组排除单相躁狂或抑郁、恶劣心境、环性心境障碍患者，排除心、脑、肝、肾、肺的严重疾病及其它严重的躯体疾病者或有物质滥用、依赖者。研究组64例，其中，男性36例、女性28例，年龄为16～62岁，平均年龄（38.3±11.2）岁；对照组100例，其中，男性58例、女性42例，年龄18～65岁，平均年龄（36.7±12.3）岁。所有研究对象均无血缘关系，并在知情同意下参加本研究。经χ2和t检验两组间性别、年龄无显著差异。
1.2 方法
1.2.1 临床诊断 研究组对象均由一名熟练掌握CCMD-3中双相障碍诊断标准的主治或主治以上的医师进行诊断，对符合双相障碍诊断标准的患者由诊断医师征询其知情同意后入组。
1.2.2 DNA的提取 每例对象抽取静脉血5ml，用1ml ACD抗凝，用饱和酚-氯仿法提取DNA。
1.2.3 基因片段扩增 采用聚合酶链式反应（PCR）扩增ACE基因片段，引物设计均参考以往文献。PCR上游引物：5 -CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3 ；下游引物： 5 -GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3；PCR反应体积为25μL，其中Taq DNA聚合酶0.4μL（5U/μL），10Xpcr Buffer（含Mg2+缓冲液）2.5μL，dNTP混合物2μL (各为2.5mmol/L)，DNA模板2μL（≤2.5ng），引物各1μL（10pmol/μL），加双蒸水至25μL；之后95℃ 4min，继而95℃ 30s, 55℃ 30s和72℃ 50s(共30个循环)，其后72℃ 7min， 4℃低温保存。在PCR产物中加入5μL的6X Loadingbuffer，于8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电压为180V，电泳3h后，进行硝酸银染色，并分析基因型。
1.2.4 统计学方法 使用SPSS15.0 录入数据。用直接计数法计算等位基因及基因型频率；用HWE软件(J．Ott，1988)对基因型进行Hardy-Weinberg平衡估计。采用独立样本t检验比较组间年龄，χ2检验比较性别差异、组间基因型及等位基因的频率。
2 结果
2.1 基因分型结果 ACE基因I/D多态性检测：PCR扩增产物经酶切后有3种基因。2、3、5、6为I/D基因型；1、8为I/I基因型；4、7为D/D基因型。基因型I/I、D/D和 I/D，表现在多态酶切电泳图上的结果即分别为490bp1条带、190bp1条带、490bp和190bp2条带（见图1）。
图1 ACE基因酶切多态性电泳图:maker为DNA标准
3.2 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验 进行χ2吻合度检验，研究组和对照组ACE基因型的实测值和理论值均符合Hardy-Weinberg平衡法则，吻合度检验良好。病例组与对照组ACE基因型的实际值和理论值比较分别为χ2=0.015，df=1,P=0.902和χ2=0.526，df=1,P=0.468。
2.3 ACE基因型和等位基因频率分布的比较 获得ACE基因型和等位基因频率值，其基因型和等位基因频率分布在研究组和对照组间无显著性差异（见表1）。表1 研究组和对照组ACE基因的基因型和等位基因频率分布比较 注：研究组和对照组基因型频率分布比较：χ2=0.463，df=2，P=0.793；两组等位基因分布比较：χ2=0.141，df=1，P=0.707。
3 讨论
ACE是肾素-血管紧张素系统中的、影响其它物质活性的重要代谢酶，其基因位于人类第17号染色体长臂q23位点，长约21 kb，含26个外显子和25个内含子。ACE基因存在数种多态性标记：T5941C，A240T，T93C，T1237C，I／D和4656(CT)2／3等，研究最多的是I／D多态性。有关心肌梗死［4］及左心室肥大［5］的高风险研究表明，携带ACE的D等位基因与ACE活性增强有关。而ACE的水平与多种精神疾病关联：Arregui［6］报道，与非自杀者对比自杀者黑质中的ACE水平升高，且早发性精神分裂症患者基底神经节的ACE活性减低；Baghai［7］等人研究显示，经过4周的抗抑郁治疗后，D等位基因携带者的HAMD17得分显著降低，缓解率升高且住院时间明显缩短，考虑D等位基因可能也影响到抑郁症的治疗。Arinami［2］等人研究显示，情感障碍和ACE的I/D多态性显著关联，情感障碍组的D等位基因和D/D基因型分布频率显著高于健康对照组；将情感障碍分成双相和单相障碍后双相障碍的关联性更显著（P＜0.006)。这些研究均支持对精神疾病，尤其双相情感障碍与ACE的I/D多态性的关联研究。但是，如同本研究的结果一样，部分研究并没有得出阳性的结果。
Pauls ［8］ 等人在德国人群中对比研究169例情感障碍（106例双相障碍，63例复发性单相障碍患者）和169例健康对照者，无论是在双相障碍还是在单相障碍患者中，均未能重复Arinami等人的结论；在巴西人群中进行的研究得出类似的结论［3］。本研究虽然亦未能显示双相障碍与ACE的I/D多态性之间存在关联，虽然在诊断方面做了严格的控制，但是存在一个缺点就是病例组的样本量比较小，可能统计学说服力要略逊一筹。
基因的变异本身受到多方面的影响，如民族、种族、人群迁移、地区等，而且可能双相障碍本身也涉及到多种神经递质及其相关基因如五羟色胺、去甲肾上腺素、P物质等。因此，多项实验所得的结论各异不能排除以上各因素及实验过程本身的影响。所以到目前为止，也并不能明确双相障碍与ACE基因的I/D多态性间是否存在关联，鉴于其病因学和治疗性意义，将来有必要对其深入探讨下去。
【参考文献】
［1］ McGuffin P,Rijsdijk F,Andrew M,et al.The heritability of bipolar affective disorder and the genetic relationship to unipolar depression［J］.Archives of General Psychiatry,2003,60：497-502.
［2］ Arinami T,Li L,Mitsushio H,et al.An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin converting enzyme gene is associated with both brain substance P contents and affective disorders［J］.Biological Psychiatry,1996,40：1122-1127.
［3］ Meira-Lima IV,Pereira AC,Mota GF,et al.Angiotensinogen and angiotensin converting enzyme gene polymorphisms and the risk of bipolar affective disorder in humans［J］.Neuroscience Letters,2000,293：103-106.
［4］ Cambien F,Poirier O,Lecerf L,et al.Deletion polymorphism at the angiotensin-converting enzyme gene is a potent risk factor for myocardial infarction［J］.Nature,1992,359:641-644.
［5］ Schunkert H,Hense H-W,Holmer SR,et al.Association between a deletion polymorphism of the angiotensin-converting-enzyrne gene and left ventricular hypertrophy［J］.N EngI J Med,1994,330:1634-1638.
［6］ Arregui A，Barer GR.Chronic hypoxia in rats：alteration of striatonigral angiotensin-converting enzyme,GABA and glutamic acid decarboxylase［J］.J Neurochem,1980,34:740-743.
［7］ Baghai TC,Schule C,Zwanzger P,et al.Possible influence of the insertion/deletion polymorphism in the Angiotensin I-converting enzyme gene on therapeutic outcome in affective disorders［J］.Molecular Psychiatry,2001,6:258-259.
［8］ Pauls J,Bandelow B,Ruther E.polymorphism of the gene of angiotensin coverting enzyme:lack of association with mood disorder［J］.J Neural Transm,2000,107:1361-1366.
作者单位：1.广州市精神病医院，广东 广州 ；2.梅州市第三人民医院