点击显示 收起
【摘要】 目的：探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况。方法:采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增；利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测。结果:25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性；25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80%，inhA基因扩增阳性率为68%。结论:耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株；PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据。
【关键词】 结核分支杆菌；异烟肼（INH）；杂交
异烟肼作为结核病治疗中主要的一线抗结核药物之一，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步的认识。其耐药性的研究日益受到重视［1］。耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变造成，与inhA基因突变也有相关性。本文采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术分别对肺结核病人痰标本直接进行基因突变检测，现将结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料 25例INH敏感株和35例耐INH临床分离株均来自吉林市结核病防治研究所。25例耐INH的肺结核病人痰标本来自该院住院结核病人。
1.2 方法
1.2.1 细菌DNA的制备 临床分离株DNA用常规酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.2.2 PCR扩增 采用25μl反应体系，4XdNTPs终浓度为0.2mmol／L，Bio-标记引物终浓度为0.2μmol／L。扩增程序为：94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测出现267bp条带。
1.2.3 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中，加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交：45℃×30min。将Bio-标记引物的PCR扩增阳性产物变性：95 ℃×10min，取出迅速放入冰盒中，每ml杂交液一般加l0μl变性的扩增产物，放置水浴锅中进行杂交：45℃×30min。洗膜：洗液1为45℃×3min，洗液2为45℃×3min。SA-AP：用1：1000的稀释液(洗液Ⅰ)与膜在37℃作用30min。洗膜：洗液Ⅰ为45℃×3min，洗液Ⅱ为45℃×3min。显色：每毫升洗液Ⅰ加入NBT 6.6μl、BICP 3.3μl混匀，将配好的显色液加入杂交袋中，闭光37℃显色5min，观察结果。
2 结果
2.1 PCR扩增，以结核分支杆菌H37RV为对照，25株药物敏感株、35株耐INH分离株两种基因扩增均为阳性， 25例耐INH肺结核病人痰标本中KatG基因20例扩增阳性，inhA基因17例扩增阳性（见表1）。
2.2 应用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测rpsL、rrs基因突变结果（见表1、2）。表1 肺结核病人痰标本的检测结果表2 临床分离株的检测结果
3 讨论
由于结核杆菌生长缓慢，使药敏测定结果需要两个月，甚至更长时间，这也是影响结核病化疗效果的原因之一。因此，建立一种新的快速、有效药敏试验方法对结核病的早期治疗具有重要意义。有研究表明［2］，耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变造成，与inhA基因突变也有相关性。通过PCR-SSCP方法得出耐异烟肼菌株时，两种基因总突变率为68.5%。但PCR-SSCP方法建立在凝胶电泳基础上，难于标准化和质量控制，难以大规模推广。通过对两基因核心易变区进行DNA序列分析，根据基因突变的中心区域，设计靶基因，制备寡核苷酸探针，点样在杂交膜上，进行PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交。
PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交检测基因突变，25株药物敏感株的KatG基因突变率分别为4.4%、0。35株耐INH分离株中，21株基因发生突变，突变率为62%；2株inhA基因发生突变，突变率为6.5%，结果与有些报道十分相近。总之，PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌KatG和inhA基因突变，为临床检测结核分支杆菌耐异烟肼的耐药性提供了初步依据。
【参考文献】
［1］ Pretorius GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampin- resistant.Mycobacterium tuberculosis by Sequencing and line probe assay［J］.Scand J Infect Dis,2001,40(2):111-121.
［2］ 张小刚，李书琳.结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测［J］.实用医学杂志,2001,17（10）:1006-1007.
作者单位：1.北华大学医学院，吉林 吉林；2.长春国际旅行卫生保健中心