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【摘要】 目的：探讨负压封闭引流促进人急性创面愈合的机制。方法：应用负压封闭引流法和换药法各治疗10例人急性创面,于治疗的0、1、3、5、7d采集创面肉芽组织和渗出液,应用免疫组化、ELISA法和Image Pro Plus 5.0软件系统检测和分析PDGF、TGF-β1的动态变化。结果：负压组两种细胞因子的表达量多于换药组。负压封闭引流治疗前创面两种细胞因子的表达在较低水平,治疗后第3d PDGF含量达到峰值,TGF-β1在第5d达到峰值,随后表达量逐渐减少,第7d仍高于治疗前水平。结论：负压封闭引流促进创面愈合可能与PDGF和TGF -β1的表达量增多有关。
【关键词】 封闭负压引流；血小板源性生长因子；转化生长因子-β；急性创面
The study of effects of vacuum sealing drainage on
PDGF and TGF-β1 expression in human acute wounds
YAN Fei,BAO Tong-zhu,LIU Wan-jun，et al
(1.The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorge University, Yichang 443003，China;2.Yichang Central People’s Hospital)
【Abstract】 Objective:To explore the mechanism of vacuum sealing drainage to accelerate healing of human acute wounds.Methods：10 cases of human acute wounds were treated respectively by vacuum sealing drainage and common gauze dressing.Granulation tissue specimens were cut and transudates were drawn from the wound bed at day 0、1、3、5 and 7. The immunohistochemistry and ELISA methods were applied to detect the expression of PDGF and TGF-β1 and the results were analyzed by Image Pro Plus 5.0 software system.Results：The expression of PDGF and TGF-β1 in the experimental group was more than in the control group. The contents of those two cytokines in a low level before using vacuum sealing drainage.At day 3 the expression of PDGF got to the peak,while TGF-β1 was at day 5.The contents decreased since then,but sustained in a high level at day 7.Conclusion：Vacuum sealing drainage can promote the healing of wounds maybe due to it can increase the expression of PDGF and TGF -β1.
【Key words】Vacuum sealing drainage；PDGF；TGF-β；Acute wound
创面愈合是一个复杂的生物学过程，受细胞因子调控［1］。在创面愈合中，转化生长因子-β(TGF-β)与瘢痕形成和成纤维细胞增殖密切相关，血小板源性生长因子(PDGF)对细胞外基质、胶质和胶原的合成有重要作用。负压封闭引流(vacuum sealing drainage, VSD)是近年来兴起的一种治疗创面的新型疗法，能促进创面愈合［2］。通过研究负压封闭引流对创面PDGF与TGF-β的影响，探讨VSD促进创面愈合的机制。
1 对象与方法
1.1 对象
无心、脑、肺、肾严重合并症的四肢急性外伤患者20例，其中，男12例、女8例，年龄20～50岁，平均35.3岁。其中，车祸伤10例，高空坠落伤4例，重物砸伤6例。创面皮肤缺损范围4cm×6cm～15cm×20cm。
1.2 方法
1.2.1 创面治疗
实验分为VSD组和换药组。VSD组在彻底清创后，剪裁合适大小的VSD海绵敷料，距创面2～3cm正常皮肤处戳孔安置引流管，敷料边缘与周围皮肤缝合固定，生物透性薄膜覆盖密封整块敷料，引流管另一端连接中心负压持续吸引，负压维持在60～80kPa。换药组采用常规伤口更换敷料的方法治疗。
1.2.2 取材
1.2.2.1 创缘组织切取
治疗的0、1、3、5、7d在创缘切取4mm×3mm×2mm的肉芽组织,10％中性甲醛固定。
1.2.2.2 创面渗出液收集
在VSD治疗的0、1、3、5、7d用1ml空针抽取生物透性薄膜下的液体0.5～3ml，6 000转离心5min，上清液置于-20℃冰箱内冻存备用。
1.2.3 实验步骤
1.2.3.1 免疫组织化学
5μm的切片脱蜡，经100%→50%梯度的酒精脱水，3％H2O2 37℃孵育10min以阻断内源性过氧化物酶。0.01mol/L PBS清洗后，10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，PBS清洗，而后分别加入1∶100兔抗人PDGF-B和TGF-β1。37℃孵育60min，0.01mol/L PBS清洗，加入生物素标记的二抗（羊抗兔IgG）37℃孵育30min，0.01mol/L PBS清洗，加入ABC复合物37℃孵育30min。DAB和3%H2O2在室温显色，切片再经梯度酒精脱水、透明、树脂封片。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗，其余方法同前。光镜下观察，PDGF和TGF-β1以胞浆着棕色者为阳性染色，采用Leica Qwin图像分析系统和Image Pro Plus 5.0图像分析软件，分别对每张切片随机选取5个不重复的阳性反应视野照像，计算平均积分光密度(aIOD)值。
1.2.3.2 ELISA
将各浓度标准品各取0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液作为零孔。样品稀释液按1:2将渗出液稀释，加入反应孔中，每孔100μl；酶标板加上盖，37℃反应90min。0.01mol/L PBS清洗，按每孔0.1ml加入1:100一抗(生物素标记抗人PDGF-B、TGF-β1)，37℃孵育60min。0.01mol/L PBS清洗，按每孔0.1ml加入1:100ABC复合物，37℃孵育30min；0.01mol/L PBS清洗，按每孔90μl依次加入已在30℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应12～16min；按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色；Sunrise酶标仪波长设置为450nm，同时测定各反应孔吸光度(OD)。
1.2.4 数据处理
采用SPSS11.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示。VSD组与换药组间差异行两样本均数差别t检验，VSD治疗后3、5、7d与0天蛋白含量的比较采用样本均数间的多重比较(Dunnett-t检验)，以0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化实验
PDGF-B和TGF-β1的阳性表达，位于血管内皮细胞及成纤维细胞胞浆内，染色呈棕黄色；VSD组两种细胞因子表达显著多于换药组，其aIOD值见表1。表1 PDGF-B、TGF-β1各时间点aIOD（略）注：实验组与对照组相比,P＜0.05，n=10
2.2 ELISA实验
VSD治疗0天，创面渗出液中PDGF-B、TGF-β1的含量较低，经VSD治疗后第1天PDGF-B、TGF-β1的含量开始升高，分别在第3、5天达到高峰，随后下降。数据显示，负压封闭引流治疗创面后第3、5、7天与治疗前相比有显著性统计学差异(P＜0.05)，见图1、2。
3 讨论
PDGF是一种重要的促进间质细胞分裂肽类调节因子，分子量约为29kD，普遍存在于正常细胞和转化细胞中。创面愈合过程中，PDGF-B来自创面成纤维细胞、巨嗜细胞和血小板的自分泌或旁分泌，参与了炎症反应及组织细胞增殖等阶段，有利于创面愈合［3］。TGF-β是一种具有同源双链25kD的多肽，创伤时机体几乎所有细胞均可产生TGF-β。TGF-β1能够趋化单核细胞、成纤维细胞，促进细胞外基质的沉积，加快毛细血管的形成［4］。负压封闭引流技术作为一种创面治疗技术，可以促进创面愈合。有学者研究证实，VSD可以增加创面血流量，提高创面细菌清除率，降低创周组织血管通透性，减轻水肿，使慢性创面创周组织c-fos基因和MMP-2、MMP-9活性降低等［5～7］ 。
本实验以人急性创面为研究对象，利用免疫组化和ELISA的方法分别观察了在VSD治疗前后TGF-β1和PDGF-B表达的情况。VSD组PDGF及TGF-β1表达明显高于换药组，并且VSD治疗创面后PDGF-B与TGF-β1的表达量显著高于治疗前(P＜0.05)，说明VSD可以提高创周组织中PDGF-B及TGF-β1水平的表达，从而促使创面修复细胞分裂增殖加快，蛋白质合成及胞外基质形成增多，加速创面愈合。原因可能是，VSD作用后创周组织血管数量增多，口径加大，创面血流量提高，从而改善了创面的缺血、缺氧状态；创面及创周组织机能改善，从而使各类生长因子表达增多［8］。其详细机制有待于进一步深入研究。
【参考文献】
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作者单位：1.三峡大学第一临床医学院,湖北 宜昌 443003；2.宜昌市中心人民医院