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【摘要】 目的：探讨在献血人员加强对隐匿性乙型肝炎检查的必要性。方法：对HBsAg检测呈阴性的献血者同时检测抗HBc，呈阳性的加测HBV DNA。结果：在15 231名HBsAg阴性献血者中共检出6份HBV DNA阳性，检出率为0.39‰。结论：现行的常规检测方法存在缺陷，造成漏检，有必要增加抗HBc的检测。
【关键词】 HBsAg；抗HBc；HBVDNA
近年来由于输血罹患肝炎的医疗纠纷时有发生，这提示血站传统的常规检查存在缺陷，乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝细胞病毒，多数感染者可无临床症状，血清标志物（HBV-M）检测是乙型肝炎感染的重要依据。而HBsAg的阴性及抗HBs的出现一直认为是HBV清除和临床痊愈的标志。随着分子生物学等技术在病毒检测中的应用，近年来发现部分复制水平较低的乙型肝炎病毒携带者血清中检测不到HBV表面抗原（HBsAg），这种感染状态可发生于抗HBs或抗HBc阴性的患者；也可见于HBV标志物全阴性的患者；部分HBsAg阴转的急性或慢性乙肝患者，其血清中仍可检测到低水平HBV-DNA或肝组织中检测出HBsAg或HBcAg，从而提出“隐匿性HBV感染”的概念［1］。本研究对常规血清学筛查合格的血清采用PCR方法进一步检测HBV DNA和抗HBc，提示目前我国现行的献血者筛查方法存在HBV漏检的情况，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 2004年9月至2006年9月吉林市无偿献血者15 231名，年龄18～55岁，按卫生部《献血者健康检查标准》体检合格后，均经乙型病毒性肝炎(简称乙肝)金标试纸条筛查HBsAg，结果均合格。抽取血样再进行筛查。
1.1.2 样本采集及处理 将采集的无偿献血者的样本3 000 g离心10分，分离血清后立即放入-70 ℃冰箱中保存。
1.1.3 试剂与仪器 血清学乙肝检测ELISA试剂盒购自上海科华公司；HBV DNA PCR试剂盒购自深圳匹基公司；LightCycler荧光PCR仪购自瑞士Roche 公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫筛查 将一次性真空管采集的6 ml献血者血样，以室温离心血清，使用全自动酶免分析仪做HBsAg ELISA检测，按仪器和试剂盒要求操作，仪器配套软件判定结果。ELISA阴性的献血者血样做抗HBc ELISA，抗HBc阳性者再做核酸扩增技术检测。
1.2.2 核酸筛查的样本准备 将抗HBc阳性标本血清每人份及阴阳对照品各100 μl分别加入到0.5 ml离心管中，按照试剂厂家提供的方法进行DNA样本提取。
1.2.3 核酸扩增及检测 取提取好的样本各2 μl加入到扩增毛细管中，按要求装载变性液、内标、探针、酶和显色剂，仪器自动完成扩增、变性、杂交、显色和光密度测定。HBV DNA的浓度通过参与实验流程的已知浓度的HBV DNA标准品，得到关于HBV DNA浓度与出现阳性扩增曲线时的循环次数(Ct)值的标准曲线，以其为标准从而得到待测标本中的病毒浓度。
1.2.4 血液筛查核酸PCR检测结果保障措施 试剂盒的扩增试剂中含有d UTP-UNG抗污染系统，可防止扩增产物的污染(扩增产物为U-DNA，可为UNG酶清除)。“假阴性”可通过在核酸提取及扩增检测全程中加同步处理的内质控，即内标来监控，内标为一段与病毒同源的核酸序列，含有相同的引物结合区，但是探针结合区经过突变技术改造异源序列，可与内标探针结合或识别，当标本检测结果为阴性时，内质控应该检测出阳性信号。否则，任何影响或抑制PCR的因素均同等影响到内质控的检测。同时提取操作不当引起的模板丢失也同等影响到内对照，所以内质控检测正常即可认为标本检测流程正常，有效避免假阴性的发生。PCR阳性的标本，用探针杂交的方法验证其特异性，由于TaqMan探针可于PCR扩增的同时杂交，所以可提高检测的效率。
1.2.5 乙型肝炎病毒血清标志物五项检测 HBV DNA阳性的标本进一步检测乙型肝炎病毒血清标志物五项。实验方法按试剂说明书进行。
2 结果
2.1 检测体系的灵敏度 试剂盒厂家给出最低检测限为5×102copies/ml 。
2.2 抗HBc阳性检测结果 15 231名献血者中有632名阳性。
2.3 HBV DNA检测结果 632名抗HBc阳性共检出6份HBV DNA阳性，检出率为0.39‰。检测结果见表1。表1 HBV血清学标志物五项检测结果
3 讨论
目前，防止经输血传播HBV的惟一措施就是检测献血者血清HBsAg。即使经过HBsAg筛查阴性之后，PCR筛查证实，仍有0.39‰(6/15231)的HBV漏检，说明为控制HBV漏检和经输血途径传播，只做HBsAg的免疫筛查是不够的，HBsAg阴性并不能保证就没有HBV感染，这应引起我国保障血液安全的决策人员、管理人员和技术人员的高度重视。
笔者检测了15 231份HBsAg测定阴性的献血者标本，有6份免疫筛查漏检献血者血样的乙型肝炎病毒血清标志物五项免疫检测结果提示，在献血者群体中存在1个尚未被注意的新血清学模式，即HBsAg和HBeAg阴性、抗HBc阳性。由于这一模式存在免疫标志物HBcAb阳性，说明其HBV的漏检不是免疫窗口期所致，可能的因素是HBsAg检测试剂灵敏度不够，HBV的S基因、X基因变异导致HBV低水平的复制和HBsAg阴性的慢性无症状HBV携带者，尤其是后者的隐匿性已构成对血液安全的威胁［2，3］，同时也提示抗HBc筛查在控制乙肝病毒漏检和经输血途径传播中的意义。
对6名献血者血样的HBV定量检测表明，含量在（5.2～3.2）×103copies/ml之间，较文献报道的每单位血传播HBV的危险性为1/63 000要高得多［4，5］，这可能与所用PCR方法的灵敏度较高有关。本研究结果显示，HBV DNA测定阳性者均为较弱阳性，说明感染者可能处于病毒复制不太活跃的时期，血循环中病毒含量不高。HBV隐匿性感染常见于血清中仅有抗HBc阳性的人群，表现为HBsAg表达水平低或不表达，而在血清或肝组织中能检测到的HBV DNA也多为病毒滴度很低。因此在血站筛检献血者时，有必要加测抗HBc的检测，阳性者高度怀疑为隐匿性乙型肝炎，不宜作为献血源。采用PCR方法检测HBV DNA，虽然可增加检测的灵敏度，但由于成本较高，要求严格，建议有条件的地区可以考虑采用。
【参考文献】
［1］ Brechot C，Thiers V，Kremsdorf D，et al.Persistent hepatitis B virus in-fection in subjects without hepatitis B surface antigen:clinically signifi-cant of purely"occult"?［J］.Hepatology，2001，34（1）:194-203.
［2］ CacciolaI,PollicinOT,SquadritOC，et al. Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease［J］.N Engl J Med，1999,341：22-26．
［3］ Dow BC，Peterkin MA，Green RH，et al．Hepatitis B virus transmission by blood donation negative for hepatitis Bsurface antigen,antibody to HBsAg,antibody to hepatitis B core antigen and HBV DNA［J］.Vox Sang,2001,81:140.
［4］ 黄呈辉，陈汝光，黄建国，等．核酸扩增检测在血液筛查的初步应用［J］.中华检验医学杂志，2001，24：141-143．
［5］ 王培华．输血技术学［M］.第2版．北京：人民卫生出版社，2002：90.
作者单位：北华大学附属医院检验科，吉林 吉林 132011