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【摘要】 目的：了解口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者HBV P区发生YMDD 变异的情况, 并探讨其相关影响因素。方法：应用实时荧光PCR法检测HBV YMDD变异株的方法, 对214 例用拉米夫定进行抗乙肝病毒治疗的慢性乙肝(CHB)患者血清进行HBV P区YMDD变异检测分析。结果：214 例慢性乙肝患者 YMDD 变异率为 32.7 %, 其中 YIDD 变异 34例, YVDD 变异30例, 混合变异6例。YMDD 未变异组治疗前谷丙转氨酶(ALT) 水平显著高于变异组; 而 YMDD 变异组治疗前 HBV DNA 含量显著高于未变异组; YMDD 未变异组与变异组之间治疗前的患者性别、年龄和 HBeAg 状态等方面差异无统计学意义。结论：HBV YMDD 变异可能与患者治疗前 ALT 水平和 HBVDNA 含量有一定关系, 而与患者的性别、年龄和血清 HBeAg 状态无关。
【关键词】 乙型肝炎；病毒； YMDD变异
拉米夫定是常用的核苷类抗乙肝病毒(HBV)药物, 对乙肝病毒有明显抑制作用, 但长期使用易出现耐药性, 可引起 HBV 出现 P 基因酪氨酸- 蛋氨酸- 天冬氨酸- 天冬氨酸(YMDD) 基因变异, 使得HBV对拉米夫定的敏感性大大降低。本文对214例慢性乙肝患者血清标本进行了 YMDD 检测, 同时观察其血清 HBV- DNA 和 ALT 水平变化以及与乙肝血清标志物的关系, 进一步了解拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中 HBV YMDD 变异的发生情况并探讨与拉米夫定耐药相关的影响因素。
1 资料与方法
1.1 标本来源 全部血清标本均为本院 2003 年 7 月至2007年 6 月住院口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者共214例, 其中男 120 例, 女 94 例, 平均年龄为(38.9±17.5)岁, 诊断符合 2000 年西安会议制定的病毒性肝炎防治方案的诊断标准［1］。YMDD变异检测均在患者服用拉米夫定治疗（0.1/d）满48周后进行。
1.2 方法
1.2.1 YMDD变异检测 采用实时荧光PCR法。试剂盒购自杭州博康生物科技有限公司。用煮沸法处理血清标本，取2 μl处理好的模板加入18 μl反应液中，在AB7500荧光PCR仪（美国生物工程公司生产）上检测。反应条件：37 ℃ 3 min，92 ℃ 1 min，1个循环，温度变化速率为20 ℃/s；93 ℃2s，42 ℃ 20s，72 ℃ 20s，40个循环，温度变化速率为20 ℃/s；37 ℃ 3min，然后以5 ℃/s温度变化速率上升至70 ℃。循环结束后，用Light Cycler软件对结果进行分析，根据病毒株熔解温度差异来判断病毒株类型，YVDD变异株熔解温度峰值最高（58 ℃±1.5 ℃），其次是野生株（50 ℃±1.5 ℃），而YIDD变异株峰值最低（42 ℃±1.5 ℃）。
1.2.2 HBV DNA定量 实时荧光PCR法，仪器为AB7500荧光PCR仪、试剂盒购自杭州博康生物科技有限公司，操作步骤严格按说明书进行。
1.2.3 血清标志物（HBVm）测定 采用ELISA法，试剂由上海科华生物工程公司提供。
1.2.4 ALT测定 试剂由北京利德曼生物有限公司提供，采用速率法测定。
1.3 统计学方法 率的比较应用卡方（x2）检验，计量资料以均数±标准差表示，组间比较应用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 YMDD检测结果 214例标本中检出 YMDD变异株70例 (32.7%), 其中YIDD变异34例，YVDD变异30例, 混合变异(YIDD+YVDD)6例; 野生株144例(67.3%)。
2.2 YMDD变异与拉米夫定治疗前病毒核酸水平 HBV DNA含量以拷贝/ml的对数值表示，YMDD野生型组拉米夫定治疗前HBV DNA含量为4.24±1.09，YMDD变异型组HBV DNA含量为5.18±1.95,两组比较差异有显著性意义（t=3.67，P<0.01）。
2.3 YMDD变异与拉米夫定治疗前ALT水平的关系 YMDD变异组ALT水平为（116.75±56.74）IU/L；YMDD野生组ALT水平为（245.50±111.40）IU/L。两组ALT水平的差异有显著性意义（t=7.22，P<0.001）。
2.4 YMDD变异与拉米夫定治疗前血清标志物的关系 YMDD变异型组患者HBeAg阳性率为60.0%（42/70），野生型组患者为51.4%(74/144)，两者比较差异无统计学意义（x2=0.70, P> 0.05）。
2.5 YMDD变异与患者性别和年龄的比较 YMDD变异组患者平均年龄为(39.4±9.7)岁, 未变异组患者平均年龄为(36.7±12.9)岁, 两者比较差异无统计学意义(t=0.52，P>0.05), 同样 YMDD 变异组患者男40 例, 女 30 例, YMDD 未变异组患者男 80 例, 女64 例，两组之间男女性别差异无统计学意义 (x2=0.024, P>0.05)。
3 讨论
拉米夫定是核苷类抗病毒药物, 它与乙肝病毒多聚酶结合后, 竞争性抑制多聚酶活性, 使 HBV DNA 的链合成终止, 从而有效地抑制 HBV DNA 的复制［2］, 同时伴有 ALT 恢复, 肝组织病理改善。长期应用拉米夫定, 一般疗程超过 6 个月以上开始产生病毒变异, 并可产生耐药, 导致病毒复制重新活跃, 甚至病情的加重或死亡［3］。病毒的变异率随疗程的延长而升高。有文献报道 16%～32%的患者在用拉米夫定治疗 1年后, 发现 YMDD 突变, 并伴随 HBV DNA 和ALT 水平上升［4］，本研究发现拉米夫定治疗满48周的慢性乙型肝炎患者 YMDD 的变异率为 32.7%, 与文献报道基本一致。有文献报道使用拉米夫定发生 YMDD 变异的预测因子包括未联合干扰素治疗、治疗前ALT基线水平较低、HBV DNA 滴度较高和肝硬化［5］。本研究发现 YMDD 变异组治疗前的 HBV DNA 水平明显高于 YMDD 未变异组, 表明用药前血清 HBV DNA水平即乙肝病毒复制的载量是发生 YMDD 变异的相关因素, 这与谢秀芹等［6］的报道一致。YMDD 未变异组治疗前的 ALT 水平明显高于 YMDD 变异组, 表明治疗前的 ALT 水平和发生 YMDD 变异有一定的相关性, 高滴度的 HBV DNA 水平和低水平的ALT 可能是其发生 YMDD 变异的相关因素, 由于慢性乙型肝炎患者 ALT 水平升高属于 T 细胞介导的肝细胞溶解反应, 故 ALT 水平也就反映了 T 细胞对HBV 的免疫反应情况, 对于那些 HBV 已开始产生免疫反应的患者, 用拉米夫定治疗的效果较好。这可能是治疗前 ALT 水平较高的患者不容易产生变异的原因。同时本结果表明 YMDD 变异与治疗前的患者性别、年龄和 HBeAg 状态等方面无明显关系。
总之, 拉米夫定治疗 HBV 感染的长期疗效与患者是否出现 HBV DNA P 区 YMDD 变异密切相关。因此, 在拉米夫定用药过程中需严密观察 HBV- DNA 含量和 ALT 水平变化, 一旦出现YMDD 变异, 应立即调整治疗方案，如联合或换用阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦、干扰素等。
【参考文献】
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［6］ 谢秀芹,许家璋,郜玉峰,等.拉米夫定治疗后发生 YMDD 变异的相关因素分析［J］.中华传染病杂志,2005,23(5): 314- 317.
作者单位：新乡市传染病医院，河南 新乡 453000