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【摘要】 目的 研究钙拮抗剂与ACEI类药物在较低药物浓度下合用对抑制肺主动脉血管平滑肌细胞增殖作用的影响。方法 培养大鼠肺主动脉血管细胞，观察药物Nifedipine，Captopril，Diltiazem，Enalapril以及Nifedipine与Captopril，Diltiazem与Enalapril合用对肺主动脉血管平滑肌细胞增殖作用的影响。结果 Nifedipine与Captopril，Diltiazem与Enalapril合用，在10 -10 mol/L药物浓度下，仍能明显抑制15%FBS所致的肺主动脉血管平滑肌细胞的增殖（与对照组相比，P<0.05）。结论 Nifedipine与Captopril、Diltiazem与Enalapril合用，在较低的药物浓度下，具有抑制肺主动脉血管平滑肌细胞增殖的协同作用。
关键词 肺动脉高压 血管平滑肌细胞 增殖 抑制 钙拮抗剂 血管紧张素转换酶抑制剂
肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）是临床常见疾病，发病率及病死率均较高，且发病机制尚不十分清楚，目前亦无比较满意的疗法。肺动脉高压的两大基本病理改变是肺血管收缩和肺血管平滑肌构型重建，因此抑制肺血管收缩以及阻止肺血管平滑肌细胞增殖增强是治疗肺动脉高压的关键。其中肺血管平滑肌构型重建尤为人们所重视，所以是肺动脉高压研究领域中的热点之一 ［1～3］ 。
血管构型重建包括细胞外基质在血管壁的合成、沉积以及血管平滑肌细胞的增殖、迁移等病理变化。肺动脉高压时肺血管形态学主要结构变化是肺动脉特别是肺小动脉的管壁变厚、管腔变小。动脉增厚是由于大血管平滑肌细胞异常增殖，而阻力血管是由于血管平滑肌细胞增生和向内膜下迁移 ［4］ 。
近年来的研究表明，中小动脉肥厚既可以是肺动脉高压的病因，又可以是肺动脉高压的结果，甚至认为肺动脉高压不是功能性疾病，而是结构性疾病，主张治疗在控制血压的同时能逆转血管平滑肌构型重建 ［5，6］ 。
许多相关研究发现，无论在体内、体外刺激VSMC的增殖，均能被一些药物所抑制。从大量的实验研究结果中，人们对许多现有的抗血压药物的作用又有了新的认识和了解。目前，药物逆转肺血管平滑肌构型重建的作用越来越受到人们的关注。
Nifedipine，Diltiazem，Captopril，Enalapril能逆转肺动脉高压时血管重构的作用已为许多研究所证实 ［7～11］ 。但不同的钙拮抗剂与血管紧张素转换酶抑制剂合用，对血管平滑肌细胞增殖的影响进行比较的研究较少。为此，本文在研究Nifedipine，Diltiazem，Captopril，Enalapril对肺主动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC）增殖影响的同时，着重研究低剂量药物合用对抑制PASMC增殖作用的影响。
1 实验材料
1.1 药品与试剂 Nifedipine:上海第十七制药厂;Diltiazem Hydrochloride:天津田边制药有限公司;Captopril，（CI0401）、Enalapril Maleate，（990806）:常州制药厂;胎牛血清（fetal bovin serum，FBS）;天津TBD生物技术发展中心（200102）;Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）干粉培养基、胰酶（Tyrosin）:美国Gibco公司产品;二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐（MTT）:上海化学试剂站分装厂;其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器 细胞培养瓶（25cm 2 ）、96孔细胞培养板、24孔细胞培养板:丹麦Nunclon公司产品;二氧化碳培养箱:美国Forma Scientific产品;Model550型酶标仪:日本BIO-RAD产品;SW-CJ-2FD型净化工作台:苏州安泰空气技术有限公司产品;M021型倒置相差显微镜;日本Olympus公司产品。
1.3 实验动物 雄性Wistar大鼠，8周龄，体重在274±16g，中国医科大学实验动物部提供。实验动物合格证号，No.辽实动字034号。
2 实验方法
2.1 大鼠肺主动脉血管平滑肌细胞原代及传代培养 参照文献 ［12～14］ 所述方法进行，取8周龄、体重为274±16g的雌性Wistar大鼠，在无菌条件下取肺主动脉，以贴块法进行原代PASMC培养。15h左右可见PASMC生长，镜下细胞呈梭形，典型的峰、谷状，进行换液，长满培养皿后，进行传代。直至细胞数量增殖到一定数量后，接种于96孔培养板用于实验研究。实验所用的PASMC为第五代细胞。
2.2 Nifedipine、Diltizem、Captopril、Enalapril对PASMC增殖的作用 对照组的96孔培养板，培养液为不含药物的15%FBS的DMEM培养液，实验组的96孔培养板除含15%FBS的DMEM培养液外，再按含有的药物不同，分成Nifedipine、Diltiazem、Captopril、Enalapril系列浓度组（10 -4 、10 -5 、10 -6 、10 -7 、10 -8 、10 -9 mol/L），继续培养20h后，进行MTT法的测定。比较不同的浓度条件下对PASMC增殖的影响。
2.3 Nifedipine与Captopril、Diltiazem与Enalapril的合用对PASMC增殖的作用 对照组的96孔培养板，培养液为不含药物的15%FBS的DMEM培养液外，再按含有的药物不同，分成Nifedipine（10 -10 mol/L）+Captopril（10 -10 mol/L）、Diltiazem（10 -10 mol/L）+Enalapril组（10 -10 mol/L）继续培养20h后，进行MTT法测定。比较低浓度条件下的联合用药对PASMC增殖的影响。
3 统计学处理
所有数据以均值±标准差表示，利用Statistical Program for Social Sciences（SPSS）软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用Student Newman-Keuls t检验。当P<0.05时，为差异有显著性。
4 实验结果
4.1 Nifedipine、Diltiazem、Captopril及Enalapril对FBS刺激的PASMC增殖作用的影响 与对照组相比，Nifedipine、Diltiazem、Captopril及Enalapril系列浓度实验组对15%FBS刺激PASMC增殖的作用均有不同程度的抑制作用，且呈浓度依赖性，当药物浓度降到一定浓度下，对PASMC增殖的抑制作用不显著（见表1）。
表1 实验组对PASMC增殖的影响结果 （x±s，n=9）（略）注: ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01
4.2 Nifedipine+Captopirl实验组、Diltiazem+Enalapril实验组对PASMC增殖的影响 与对照组相比，较低药物浓度的Nifedipine+Captopril实验组及Diltiazem+Enalapril实验组对PASMC增殖也均有不同程度的抑制（见表2）。
表2 Nif+Cap、Ena+Dil实验组对PASMC增殖的影响 （x±s）（略） 注: ˇ P<0.05
5 讨论
肺动脉高压时，血管平滑肌细胞在血管切应力增加及神经体液等因素改变的刺激下，动脉的肌化及平滑肌细胞表型的转化，发生增殖、肥大，形成高血压病和VSMC异常增殖之间的恶性循环 ［15，16］ 。所以说，血管平滑肌细胞异常增殖是高血压等血管增生性疾病的病理基础 ［17，18］ 。
已往的大量研究报道均说明体液因子在肺动脉高压时的血管构型重建过程起决定作用。但是，这些报道均是研究某一体液因子的作用及作用机制以及某一药物以某一体液因子的作用机制的探讨性研究。由于机体是复杂的因素综合体，很难说明是某一因素在肺动脉高压的血管构型重构中起决定作用，如交感活性增高，去甲肾上腺素分泌增多以及肾素-血管紧张素系统活性增强，循环血中增高的血管紧张素Ⅱ和血管局部自分泌旁分泌的血管紧张素Ⅱ，细胞外钙离子都是VSMC增殖的促进因素 ［19，20］。既是说，不是某一个体液因子导致PASMC增殖、肥大及迁移，是多种因素共同作用的结果。从这一观点出发，本实验选用15%FBS作为刺激PVSMC生长的因素，并通过实验来证实这一观点。
研究的结果显示，钙拮抗剂（Nifedipine、Diltiazem）、血管紧张素转换酶抑制剂（Enalapril、Captopril）对高浓度胎牛血 清（FBS）刺激的体外培养的大鼠PASMC的增殖均有不同程度的抑制作用。且药物的不同浓度对PASMC的生长、增殖的抑制程度不同。高浓度的药物作用强一些，随着药物浓度的降低，作用明显降低，而且达到某一药物浓度时，对PASMC增殖的抑制作用不显著，呈浓度依赖性的关系。而以往的研究表明，某一体液因子刺激的肺主动脉细胞的增殖，在较高浓度的药物的作用下，PASMC增殖均有不同程度的抑制，而当药物的浓度降低以后，作用也减弱甚至无抑制作用。这表明，本实验与已往的实验结论相一致。
本实验中，首次证明联合用药对体外培养PASMC生长及增殖的作用有显著影响。当把低浓度的两种药物联合使用时，发现培养的PASMC的生长、增殖明显被抑制。这一现象提示我们，在抗高血压的治疗时的联合用药，即使使用的药物的血药浓度较低，在能够控制血压的同时，也可能抑制肺动脉高压时的PASMC的生长、增殖，进而逆转肺血管构型重建。
由于本研究仅仅是对钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂的少数几种药物影响PASMC增殖的作用进行的初步研究，因此尚有一定的局限性，还需在今后的研究中进一步探讨其它药物对PASMC增殖的影响及其作用的机制。
6 结论
6.1 钙拮抗剂Nifedipine、Diltiazem、ACEI类 Captopril、Enalapril能够浓度依赖性地抑制PASMC的增殖。
6.2 Nifedipine与Captopril、Diltiazem与Enalapril合用，在较低药物浓度下具有抑制PASMC增殖的协同作用。
参考文献
1 Voellkel NF，Tuder RM. Cellular and molecular mechanisms in the pathegenis is of severe pulmonary hypertension. The European Respiratory Journal，1995，8:2129-2138.
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4 Wen JK，Shi Y. New approaches on regulatory mechanisms of vascular smooth muscle cell proliferation. Proceedings of the physiology，1996，27（2）:149-156.
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