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【摘要】 目的 观察续断对去势大鼠骨量和血清胰岛素样生长因子（Insulinlike Growth Factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）等指标的影响。方法 12月龄雌性SD大鼠随机分为空白对照组（OVX）、雌激素对照组（OVX+E）、续断1、2、3组（OVX+X1、X2、X3），卵巢切除后7天开始给药，术前和3个月后2次检测骨量，然后处死大鼠，检测血清IGF-Ⅰ、ALP、Ca和P。结果 空白对照组实验前后骨量显著减少，雌激素对照（倍美力）组和续断2、3组的骨量显著高于空白对照组;续继1、2、3组血清IGF-Ⅰ均显著高于空白对照组和雌激素对照组;实验后各组ALP、Ca和P比较差异无显著性。结论 续断有效防止卵巢切除大鼠骨的丢失可能与其增加IGF-Ⅰ的表达有关，可用于骨质疏松的防治。
关键词 骨质疏松 骨密度 雌激素 续断
The effects of Radix Dipsaci on the bone mass and serum insulin like growth factor-I in the ovariectomized rat
Cheng Zhian，Shen Huiyong，Liu Hanlin，et al.
Memorial Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou51
0120.
【Abstract】 Objective To observe the influence of Radix Dipsaci on the bone mass and serum insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）in the ovariectomized rat.Methods Fifty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups:control group（OVX group），conjugated estrogen group（OVX+E group），and Radix Dipsaci（Xuduan）1，2，3groups（OVX+X1，X2，X3groups），and the drugs or placebo was given per oral daily for3months from the day7of having been ovariectomized.The whole body bone mineral density（BMD）and bone mineral contents（BMC）were measured，and the serum IGF-Ⅰ，alkaline phosphatase（ALP），calcium，phosphates，the femur BMD，BMC and calcium were tested3months later after the rats were killed.Results OVX+E group and OVX+X2，X3groups had higher mean levels of whole body and femur BMD，BMC and femur calcium than OVX group，the serum IGF-Ⅰof the OVX+X1，2，3groups was significantly higher than that of the OVX and OVX+E groups.Concluˉsion Radix Dipsaci can effectively inhibit bone loss induced by ovariectomy in the SD female rat and increase the serum IGF-Ⅰlevle.Radix Dipsaci has positive effects on bone and preventing osteoporosis.
Key words osteoporosis bone density conjugated estrogen Radix Dipsaci
续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai.的干燥的根。（秋季采挖，除去根头及根须，用微火烘至半干，堆至“发汗”至内部变绿时，再烘干，切片。性微温，味苦、辛，归肝、肾经。具有补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏的作用。用于腰膝酸软、风湿痹痛，崩漏下血、跌打损伤等。实验研究表明，续断能促进成骨细胞增殖、分化 ［1，2］ ，为了进一步探讨其是否具有防治骨质疏松（Osteoˉporosis，OP）的作用，我们进行了动物实验研究，现将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）实验用药:续断购自广州市中药材公司。倍美力（共轭雌激素）由惠氏-立达（Wyeth-Lederle）中国有限公司（苏州）提供，戊巴比妥钠（上海行知化工厂）;血脂、钙、磷、碱性磷酸酶检测试剂由孙逸仙纪念医院生化实验室统一购进（上海长征-康仁医学科学有限公司等提 ˇ 基金项目:中山医科大学科研启动基金资助（NO.B002000006）作者单位:1510120广州中山医科大学孙逸仙纪念医院2湖北省襄樊市第一人民医院 3深圳市中医药研究所 供）。大鼠IGF-ⅠRIA试剂盒（Diagnostic Systems Laboratoˉries，In，USA提供）。（2）实验动物:12月龄普通级雌性SD大鼠，重220～300（256.71±30.79）g，由中山医科大学动物实验中心提供。（3）实验仪器:骨密度仪为美国HOLOGIC公司QDR-4500A型双能X线吸收仪，变异系数（CV）<1.0%;F2-2008型γ放射免疫记数器，国营西安262厂;HIˉTACHI180-70原子吸收分光光度计，HITACHI7170A生化自动分析仪。
1.2 方法
1.2.1 OP大鼠动物模型的建立
雌性SD大鼠用0.86%的戊巴比妥钠按43mg/kg体重腹腔注射麻醉后，按文献方法 ［3］ ，在无菌条件下，由背侧入路，摘除双侧卵巢。术后第1、2天腹腔注射青霉素常规抗感染治疗。术后2周开始喂药，3个月处死大鼠。
1.2.2 实验动物分组
造模前称重，检测大鼠全身骨密度（Bone Mineral Density，BMD）和骨矿含量（Bone Mineral Conˉtents，BMC），并根据大鼠的体重和骨密度差异，将50只SD大鼠分成5个等级，然后再随机分为空白对照组（OVX）、标准对照组（倍美力OVX+E）、续断组1、2、3组（OVX+X1、X2、X3），共5组，每组10只大鼠。
1.2.3 灌胃剂量
造模后2周开始喂药。续断3个实验组分别按2g生药/（10ml·kg），4g生药/（10ml·kg），8g生药/（10ml·kg）灌胃，每日1次;空白对照组每日按（10ml生理盐水/kg）灌胃1次;标准对照组每日按0.125g/（10ml·kg）灌胃，每日1次。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
1.2.4 全身骨密度的测定
造模前和造模后90天2次检测全身骨密度。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，展开大鼠四肢和尾巴置于骨密度仪探头下，用小动物软件进行扫描和分析。
1.2.5 标本采集和处理
用药3个月后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，血液离心后取血清，分装后低温冷藏以备检测。处死大鼠，取大鼠股骨和胫骨等并剔除骨上附着的软组织，低温冷藏以备检测。
1.2.6 血清IGF-Ⅰ的放免检测
按试剂盒使用说明书进行，血清使用前避免反复冻融。结果计算使用对数-线性坐标纸，在半对数（对数-线性）纸上，以Rat IGF-Ⅰ标准液为Y轴，Rat IGF-Ⅰ浓度为X轴，取双份值的均数点作标准曲线，标准曲线的回归系数R为0.9931。从标准曲线上确定质控品和样品Rat IGF-Ⅰ2份浓度的均值。任何样本的值高于标准曲线的最高值，均应用Ong/ml Rat IGF-Ⅰ标准液稀释并重新检测。任何样本的值低于标准曲线的最低值应同样报道。
1.2.7 股骨BMD和BMC的检测 处死大鼠取骨后，取已经剔除软组织的右侧股骨测量BMD和BMC。
1.2.8 股骨干重、灰重及骨钙含量的测定
将剔除附着软组织的股骨用2份三氯甲烷和1份甲醇混合液中脱脂72h，置120℃烘箱中烘烤1h，称重即为去脂干重。把去脂股骨置白金坩埚放入Muffer炉中800℃灰化12h，使之呈白色粉末，然后称灰重。将灰用1ml的HNO 3 :H 2 O（
1:1）完全溶解，然后以原子吸收分光光度计测定骨钙含量。
1.2.9 血清生化指标的检测
邻-甲酚酞络合酮（CPC）比色法测定血清钙（Ca），速率法（DGK）测定血清碱性磷酸酶（ALP）。
1.3 统计学处理
各项实验数据均用SPSS12.0软件行方差分析，并用Newman-Keuls法进行组间比较。各项参数均以均数±标准差（ˉx±s）表示，统计检验的显著性检验水准α=0.05。
2 结果
造模前，各组大鼠的体重、BMD和BMC比较差异均无 显著性。实验后各组动物的体重都有不同程度的增加，但实验前后体重比较差异无显著性（P>0.05，见表1）。
表1实验前后各组动物的体重（略）各组大鼠实验前、后全身BMD和BMC比较，空白对照组实验后较实验前显著减少（P<0.05），其它各实验组实验前、后差异无显著性（P>0.05，见表2、3）。
表2 实验前后各组大鼠的BMD比较 （略）
表3 实验前后各组大鼠的BMC比较 （略） 注:与空白对照组比较 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，与标准对照组比较P>0.05。
实验后各组大鼠体重比较，各组间差异无显著性（P>0.05）。各组BMC及BMD比较，续断2、3组与空白对照组之间差异有显著性（P<0.05或P<0.01），但续断组与标准对照组比较差异无显著性（P>0.05）（见表1、2、3）。
表4 实验后各组大鼠股骨干重、灰重和骨钙含量的比较 （略）注:与空白对照组比较 ˇˇ P<0.05， ˇ P<0.01，与标准对照组比较P>0.05
表5 实验后各组大鼠股骨BMC和BMD的比较组别 大鼠数 注:与空白对照组比较 ˇˇ P<0.05， ˇ P<0.01 实验后股骨BMC、BMD、干重、灰重、骨钙含量比较，续断2、3组与空白对照组之间差异有显著性（P<0.01或P<0.05），但续断各组BMC、BMD与标准对照组比较差异无显著性（P>0.05）（见表4、5）。
各组大鼠血清IGF-Ⅰ与空白对照组和标准对照组比较均显著增高（P<0.05），ALP、Ca及P比较差异均无显著性（P>0.05）。（见表6）
表6 实验后各组大鼠血清钙、磷、ALP及血清IGF-Ⅰ比较 注:与空白对照组比较 ˇ P<0.05，余各组间比较P>0.053 讨论中医理论认为，“肾藏精”（《灵枢·本神》），“肾主身之骨髓”（《素问·四时刺逆从论》），主生长、发育、生殖，肾精亏虚是衰老的主要原因。续断具有补肝肾、强筋骨、续折伤等作用，是治疗腰膝酸软、跌打损伤、骨折等证的良药。其主要成分为刺楸皂甙A，川续断皂甙B，三萜皂甙等 ［4］ 。近年来的研究结果表明，续断对OP防治有确切疗效、对成骨细胞增殖有促进作用 ［1，2］ ;现代药理学研究表明，川续断对未孕或妊娠小鼠子宫皆具有显著的抑制收缩作用，抑制妊娠小鼠离体子宫的自发收缩频率，抑制妊娠大鼠子宫的收缩幅度，并具有降低张力的作用 ［5］ 。川续断总生物碱能显著抑制妊娠大鼠在体子宫平滑肌的自发收缩活动，降低其收缩幅度和张力，对抗0.25U/kg催产素诱发的妊娠大鼠在体子宫收缩幅度和张力的增加;并具有对抗大鼠摘除卵巢后导致的流产作用 ［6］ 。这些作用表明续断具有类雌激素和孕激素的作用。续断能促进实验性骨折的愈合 ［7］ 并可增加骨痂羟脯氨酸的含量和钙的含量。提高成骨细胞的活性和数量、促进基质钙化、促进骨痂生长、加快骨痂的改建 8，9］ 。OP的发生是一个渐进性的过程，以骨量减少，骨的体积密度降低，骨组织的微结构破坏为特征。随着骨量的减少，骨的机械强度逐渐衰减，骨折的危险性随着增加。绝经后雌激素的缺乏和随着年龄增长其他激素和细胞因子缺乏和失调都是引起骨丢失的主要原因。研究表明卵巢切除使大鼠雌激素缺乏导致骨呈高转换状态，骨的吸收和形成均增加，但吸收远远超过了形成从而导致了骨的丢失。雌激素缺乏对成骨细胞和破骨细胞的形成均有刺激作用，但由于成骨细胞形成的新骨的数量难以弥补破骨细胞吸收所形成的陷窝。其作用通过各种甲状旁腺激素等激素和很多细胞因子的调节表现出来［10，1。骨量的获得或骨的丢失受遗传和环境因素调节，IGF-Ⅰ在这两个过程中起着关键性的作用。IGF-Ⅰ在骨组织中的丰富储量，及其能促进成骨细胞的增殖与分化、有助于维持成骨细胞显型、抑制胶原蛋白酶活性的特性，它在骨吸收和形成耦联过程中起着重要 作用 12］ 。血清IGF-Ⅰ水平和不同位置骨骼的骨密度之间的相关性，以及获得骨峰值的快速生长发育的青少年时期IGF-Ⅰ达到了最高水平，表明血清IGF-Ⅰ和骨密度密切相关。
短期研究表明，卵巢结扎导致雌激素缺乏的同时，也可使血清IGF-Ⅰ水平和骨、小肠IGF-Ⅰ的含量升高，同时可导致血清IGFBP 3 水平显著降低 ［14］ 。但也有报道表明卵巢结扎对IGF-Ⅰ或Ⅱ无明显影响 ［11］ 。临床研究报道雌激素不仅可降低健康和子宫切除绝经后妇女外周血IGF-Ⅰ水平 ［15］ ，而且可提高绝经后妇女的身体指数和BMD ［16］ 。这些研究报道一方面说明卵巢结扎导致雌激素缺乏，使血清和骨组织IGF-Ⅰ水平升高，同时表明骨转换和重建的加速和IGF-Ⅰ有关。但是上述实验报道均为成年大鼠（6周、8周和95天），实验周期较短（3周、5周和30天）。本研究为老龄大鼠（12月龄），实验周期为3个月，结果表明雌激素治疗组和空白对照组血清IGF-Ⅰ水平差异无显著性，虽然同上述实验报道不相吻合，但从另一个方面说明，老龄去势大鼠长期雌激素缺乏后IGF-Ⅰ代谢趋于稳定，长期雌激素治疗对血清IGF-Ⅰ水平无明显影响。
本实验的结果表明，续断能有效提高去势大鼠的BMD、BMC和骨钙含量，升高血清IGF-Ⅰ水平，因此续断防治雌激素缺乏导致的骨丢失可能与增加IGF-Ⅰ的表达有关。
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（收稿日期:2004-05-01）
（编辑青 山）