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【摘要】 目的 探讨槲皮素（Quercetin，Que）对大白鼠心室肌细胞缺氧损伤的保护作用。方法 运用全细胞膜片钳技术记录缺氧模型下大白鼠心室肌细胞持续性钠电流（I Na·p ）的变化及施加Que对其的影响。结果 心室肌细胞缺氧3min后其I Na·p 开始增大，以后随着时间的延续更进一步增大，15min后基本稳定，此时施加10μmol/L的Que，可使I Na·p 明显减小（n=6，P<0.01）。结论 Que明显抑制缺氧条件下大鼠心室肌细胞I Na·p 的作用可能与其抗氧化机制有关。
关键词 心肌 缺氧 持续性钠电流 槲皮素
Effect of Quercetin on persistent sodium current of ventricular myocyte in rat during hypoxia
Zhang Peihua，Ma Jihua，Luo Antao
Cardio-Electrophysiological Research Laboratory，Medical College，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan430080.
【Abstract】 Objective To inquiry into the protection function of Quercetin（Que）on the ventriular myocyte in rat during hypoxia.Methods The whole cell patch-clamp technique was used to recorded the changes of persistent sodium current（I Na·P ）in ventricular myocyte of rat and the effect of Que on it during hypoxia.Results The I Na·P on ventricual myocyte started to enlarge after3min hypoxia.Hereafter，it was further aggrandizment along with the conˉtinue of time and basic stability after15minutes.Exerting Que to the bath solution saturated by100%N 2 at this time，could make the I Na·P to minish obviously（n=6，P<0.01）.Conclusion That Que represses obviously the I Na·P of ventricual myocyte in rat under the hypoxia condition has something to do with its anti-oxidize mechanism probably.
Key words myocardium hypoxia persistent sodium current Quercetin
心室肌细胞持续性钠电流（Persistent sodium current，I Na·P ），也称晚钠电流 ［1］ ，系指在短暂钠电流（Trasient sodium current，I Na·T ）失活后几百毫秒时间内仍可见到钠通道活动产生的电流。其在维持动作电位平台期，跨心室壁的复极离散度方面起重要作用 ［2］ 。本实验室前期研究结果表明:缺氧可增大心室肌细胞的I Na·P ，其作用机制可能是缺氧时心肌产生的较多一氧化氮（NO）通过氧化细胞膜上钠通道蛋白所致，并且正常I Na·P 的产生可能与钠通道蛋白的部分氧化状态有关 ［3］ 。提示抗氧化类药物可能能抑制I Na·p 。Que是膳食中最常见的类黄酮化合物之一，属类黄酮化合物中的黄酮醇，有较强的抗氧化性能。其主要作用是能直接清除脂质过氧化自由基，超氧阴离子等活性氧自由基，主要表现在对缺氧再灌注损伤具有明显的保护作用 ［4～6］ 。但Que对缺氧条件下心室肌细胞I Na·p 的影响尚未见报道，本文对此进行研究，以期更进一步证实缺氧条件下心室肌细胞I Na·p 增大的机制及探讨Que对心肌缺氧损伤保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 台式液（mmol/L）:NaCl135，KCl5.4，MgCl 2 1.0，NaH 2 PO 4 0.33，HEPES10，葡萄糖10，CaCl 2 1.8。无钙台式液（mmol/L）:NaCl135，KCl5.4，MgCl 2 1.0，NaH 2 PO 4 0.33，HEPES10，葡萄糖10。KB液（mmol/L）:KOH70，KCl40，KH 2 PO 4 20，EGTA0.5，L-谷氨酸50，牛磺酸20，HEPES10，葡萄糖10，MgCl 2 3，牛血清白蛋白（BSA）20mg。酶解液:本实验采用双酶体系。称取胶原酶Ⅰ（Gibco，222u/mg）4mg，蛋白酶E（Sigma）0.4mg，BSA12mg溶于40ml无钙台式液中。槲皮素:棕黄色粉剂，分析纯，北京化工厂生产，临用时用1%二甲基砜（DMSO）的磷酸缓冲液（PBS）配制。河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）购于河北水产研究所。胶原酶Ⅰ型为Gibco公司产品，牛血清白蛋白（BSA）、牛磺酸和HEPES为Roche公司产品，其它药品均为国产。
1.2 细胞分离 成年健康大白鼠，重250～300g，雌雄不拘，由武汉动物实验中心提供清洁级大白鼠。先腹腔注射肝素2000U，20min后用20%乌拉坦（5ml/kg）腹腔麻醉，迅速开胸取出心脏，置于4℃无钙台氏液中修剪后行主动脉逆行插管后悬于Langendorff灌流装置上，用无钙台氏液灌流约5min（灌流压65～70cmH 2 O），然后改用酶解液消化30min±，接着用KB液灌流约5min后取下心脏，剪下心室肌在KB液中剪碎，经200目尼龙网过滤，依次过滤3杯，取第2杯或第3杯细胞悬液于室温中静置至少1h后用于实验。分离过程中灌流液温度保持在36～37℃，灌流液通以100%O 2 饱和。
1.3 全细胞膜片钳记录 整个实验在室温下（21±2℃）进行。将细胞悬液滴入倒置显微镜工作台上的细胞池中，待细胞贴壁后用通氧的台氏液灌流（八道灌流装置BPS-8，美国），流速约2ml/min，利用三维电动微操纵器（MP-285，Sutter，美国）移动电极至细胞上方负压吸引形成封接，待细胞钳制电阻达到并稳定在1G以上时，再施以脉冲负压吸破细胞膜，形成全细胞记录。电极由两步玻璃微电极拉制仪（PP-83，Narishige，日本）拉制，并经热抛光，内充电极内液后电阻为1.5～3.5mΩ。电流信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器（EPC-9，HEKA，德国）放大，滤波（频率2KHz）后贮存在计算机，刺激信号的控制，数据的采集和分析均由Pulse+PulseFit（HEKA，德国）完成。为排除I Na·T 的影响，所有I Na·P 幅度均在去极化测试脉冲200ms时测定。
1.4 缺氧的建立 向一密闭容器的灌流液中充以100%N 2 饱和30min以上，待细胞电流稳定后，以恒定速度灌流15min以上，同时在灌流槽上罩一相对密闭罩，向罩内通100%N 2 以防止空气中氧向灌流槽内弥散，模拟细胞外低氧环境，使氧分压在3～5min内可降至4～5KPa左右，氧分压由ISO 2 溶解氧测定仪（WPI，美国）测定。
1.5 实验步骤及资料分析 在细胞池中选取横纹清晰、边界完整、析光良好的杵状心室肌细胞进行封接。形成全细胞记录模式后5min记录正常细胞的I Na·P 作为对照，然后换以100%N 2 饱和的台式液灌流细胞，造成缺氧环境，并定时记录I Na·p 变化。缺氧15min后在缺氧台式液中加入10μmol/L的Que作用于细胞（用八道灌流装置BPS-8给药），观察I Na·p 变化。数据处理:自身对照分析，所有数据用ˉx±s表示，测量结果用t检验，P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 正常I Na·P 的记录及确认 在正常情况下，用-150mV的钳制电压施以-30mV，时程为500ms的去极化脉冲记录出I Na·T 和I Na·P ，待I Na·P 稳定后在灌流液中加入1.5μM的TTX，I Na·T 改变不大，而I Na·P 则被完全阻断（n=6，图1）。
图1 正常I Na·P 的记录及TTX对I Na·P 的影响（略）
2.2 Que对缺氧条件下心室肌细胞I Na·P 的影响 刺激方式同2.1，待I Na·P 稳定后，换以100%N 2 饱和的灌流液灌流细胞，依次记录5min、10min、15min时的I Na·P ，可见I Na·P 在缺氧5min时增大，以后随着时间的延续更进一步增大，15min后基本稳定（Fig）。然后用含有10μM/L Que并以100%N 2 饱和的灌流液灌流细胞（n=6），可见I Na·P 在Que的灌流下明显减小（图2，图3）。
图2 缺氧条件下I Na·P 的变化及槲皮素的阻断作用（略）
注:从上往下5条电流曲线依次为槲皮素、对照缺氧5min、缺氧10min和缺氧15min。
图3 缺氧条件下I Na·P 的变化及Que对I Na·P 的影响（略）
注: ˇˇ P<0.01与对照比较， ## P<0.01与缺氧5min比较， ++ P<0.01与缺氧10min比较， △△ P<0.01与缺氧15min比较。电流密度:按单位电容的电流计算。
3 讨论
Patalak等（1986）首次从单通道水平的蛙骨骼肌细胞发现有持续性钠电流（I Na·p ）存在，即在电压除极钳制后很少的几百毫秒时间内，仍可见到钠通道的活动。I Na·p 失活缓慢，参与维持动作电位的平台期，对起搏电流有一定作用，存在跨心室壁分布弥散 ［1，2］ ，而在缺氧时心室肌细胞I Na·P 增大，可加大跨室壁复极离散度，引起折返性心律失常。另外，已经观察到低氧时首先是细胞内Na + 升高，随之通过Na + -Ca 2+ 交换导致细胞内Ca 2+ 超载，而在心肌细胞缺血早期（30min内），Na + -ATP酶的活动减弱，通过Na + -H + 交换使Na + 进入这两种机制在导致胞内Ca 2+ 升高方面不起重要作用，而低浓度TTX可阻断胞内Na + 升高，这些结果提示低氧时增高的I Na·p 在细胞内Na + 升高转而引起Ca 2+ 超载的过程中发挥重要作用 ［7］ 。故探讨低氧对I Na·p 的作用及药物阻断I Na·p 均具有重要意义。
Que为广泛存在于自然界中的黄酮类化合物，在心血管疾病中的治疗前景广泛，具有清除氧自由基，降血压，保护心肌缺血再灌注损伤，钙拮抗和蛋白激酶C抑制 ［4～6］ 等多种作用。在本实验中;正常情况下引导出心室肌细胞I Na·p 之后，用钠通道阻滞剂TTX可完全阻断该电流，说明此电流确是I Na·p 。笔者在前期的研究工作中发现:缺氧可增大心室肌细胞的I Na·P ，加入NO合酶抑制剂（L-硝基精氨酸甲酯）或还原剂（1，4-二硫代苏糖醇）之后，可使增大的I Na·p 明显减小。说明缺氧条件下I Na·p 增大的机制可能是此时心肌产生较多的NO通过氧化细胞膜上钠通道蛋白所致 ［3］ ，并可推测抗氧化类药物或还原剂可能抑制I Na·p 。本实验中缺氧可使I Na·p 明显增大，加入Que后可显著抑制增大的I Na·p ，提示Que阻断I Na·p 的作用可能是由于其抗氧化机制所致。
参考文献
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（收稿日期:2004-08-10）
基金项目:湖北省自然科学基金资助项目（No.2003ABA189）及湖北省教育厅科研基金项目（No.202A01011）
作者单位:430080武汉科技大学医学院心脏电生理研究室
（编辑晓 亮）