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【摘要】 目的 研究黄芪丹参复方成分提高胎盘血供的分子机制，为临床有效防治胎盘血供不足所致妊娠并发症提供思路。 方法 提取分离有效中药黄芪、丹参复方成分，运用一氧化氮合酶（NOS）阻滞剂L-精氨酸甲酯（L-NAME）制作一氧化氮合成阻滞大鼠模型，透射电镜观察胎盘超微结构变化。 结果 模型组胎盘滋养细胞水肿，线粒体肿胀、空泡化明显，滋养细胞表面绒毛稀少，凋亡细胞增加，而中药治疗组明显较轻，凋亡数目较少，与空白组近似。 结论 黄芪丹参复方成分可能提高滋养细胞活力，阻抑滋养细胞异常凋亡，防止胎盘浅表着床，有利于滋养细胞的植入，从而达到提高胎盘血液供应的目的。
关键词 凋亡 胎盘 滋养细胞 黄芪 丹参
Study on the effects of the components of Mongolian milkvetch root and Dan-shen root compound on placental ultramicroscopic structure of nitrogen oxide synthesis blocking pregnant rats
Li Chunmei，Wang Ruoguang，You Zhaoling，et al.
Department of Intergrated Traditional and Western Medicine，Hunan Traditional Chinese Medicine College，Changsha410007.
【Abstract】 Objective To provide thoughts on effectively preventing and treating pregnant complications caused by insufficient placental blood supply by exploring the molecular mechanism of the components of Mongolian milkvetch root and Dan-shen root compound elevating placental blood supply.Methods The effective components of Mongolian milkvetch root and Dan-shen root were separated and extracted.L-Arginine methyl ester（L-NAME）was applied to pregnant rats to make nitrogen oxide synthesis blocking model and then observed the change of placental ultramicroscopic structure by transmission electron microscope.Results Placental nourish cells of model group were dropsical，mitochondrions were swelling，the phenomenon of hollowlismwas obvious，the villus on the surface of nour-ish cells was rare，the number of apoptosis cells was increased.In treating group by Chinese medicine，apoptosis cells were fewer and in the same number of blank group.Conclusion The components of Mongolian milkvetch root and Dan-shen root compound can elevate the vigor of nourish cells，prevent nourish cells abnormal apoptosis，prevent placenta being implanted shallowly in endometria and make nourish cells implanted correctly.In the way of above，it can elevate placental blood supply.
Key words apoptosis placenta nourish cells Mongolian milkvetch root Dan-shen root
妊娠高血压综合征（简称妊高征，PIH）和胎儿宫内生长迟缓（即胎萎不长，IUGR）是导致孕产妇和婴儿病率及死亡率升高的主要原因，严重影响人口质量 ［1～3］ 。确切病因均尚未明确。我们在前期研究基础上 ［4～8］ ，进一步从形态学上研究中药复方有效成分对一氧化氮合成阻滞模型胎盘、蜕膜结合部位超微形态、细胞凋亡情况的影响，探讨中药对胎盘滋养细胞侵入、胎盘化血管重铸过程的影响机制。
1 材料与方法
1.1 材料 中国科学院上海实验动物中心提供清洁级SD系大鼠110只;雌雄2∶1分笼饲养，鼠龄100～120天，体重200～250g。雌鼠按妊娠顺序随机分为模型组、空白组、对照组、治疗组，每组15只进行实验。以益气化瘀立法黄芪丹参复方组分（黄芪提取黄芪皂苷、黄酮类;丹参提取丹参酮、丹参醌、丹参酸），离心放置清液，0.25μm微孔滤膜过滤，由湖南中医学院药学院制成注射液，每毫升生药含量为2g，灭菌冷藏备用。L-精氨酸甲酯（L-NAME，L-O rnithine，USA Cayman Chemical公司产品）。H-800透射电镜，日本。
1.2 动物造模 于雌鼠妊娠第10天起皮下注射L-NAME，每天125mg/kg体重，空白组10只，于妊娠第10天开始皮下注射双蒸水，量同模型组，分别至妊娠第18天。每组于第8天及第18天测血压，24h尿液测定24h尿蛋白;妊娠第12、18天时，在25%乌拉坦麻醉下，剖腹取胎，观察子宫、胎盘形态，记录胎仔体重等各项指标。
1.3 电镜形态学检测 随机取子宫—胎盘复合体，轻柔修整后，进入预备的固定液中。2.5%戊二醛固定24h以上，2%锇酸后固定1h;50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，每级10min;Epon812环氧树脂混合液:纯丙酮=1∶1浸泡24h，37℃;Epon812纯包埋剂包埋（60℃）24h;修块、定位，中子染色，H-800透射电镜（日）下观察，摄片。统计凋亡细胞数目。
1.4 统计学方法 数据输入SPSS10.0方差分析统计。
2 结果与分析
胎盘滋养细胞、血管内皮细胞等观察:每组（空白、模型、对照组、治疗组）均放大15000倍拍摄有微绒毛覆盖的合体滋养细胞，照片2张，并对每个样本随机计数（5000倍）5个视野观察，对凋亡细胞进行统计分析。
2.1 空白组 绒毛的合体滋养细胞其表面微绒毛较密，合体细胞内仅见线粒体水肿、空泡变、绒毛间隙内仅偶见淋巴细胞，未见单核细胞，绒毛内的血管内皮细胞仅个别线粒体水肿，其他均正常，见图1。
2.2 模型组 滋养细胞胞浆严重水肿，甚至出现溶解、坏死，滋养细胞表面微绒毛稀少、水肿、变矮，甚至消失，绒毛干内细胞均有不同程度的水肿。绒毛内胎儿侧血管内皮细胞胞浆水肿，线粒体空泡变，甚至内皮间连接变短，绒毛间隙内较多炎性细胞，见图2。
图1 空8（k88854）:示绒毛间隙内的淋巴细胞及丰富的微绒毛结构（略）
图2 模12（m12，1.5万×，8882）:示合体细胞表面微绒毛稀少且水肿，合体细胞胞浆内线粒体水肿空泡变（略）
2.3 对照组 少部分合体滋养细胞胞浆水肿，其线粒体仅少数空泡变，微绒毛长而密集。绒毛间隙内较多炎性细胞，如单核细胞，绒毛干内的毛细血管内皮细胞正常，见图3。
2.4 治疗组 少部分合体细胞内胞浆局部轻度水肿，少数几个线粒体空泡变，大部分线粒体嵴存在，其表面微绒毛丰富、密集。无内网扩张，无囊泡化。绒毛干内毛细血管内皮细胞仅个别线粒体空泡变外，余均见正常，绒毛间隙偶见炎性细胞，蜕膜细胞正常，见图4。
图3 阳1（y1，1.5万×，8721）: 示合体细胞表面微绒毛密集，胞浆轻微水肿，Mit无空泡变（略）
图4 治27（z27，1.5万×，8696）:示合体细胞的微绒毛丰富，整齐，胞浆内质网发达，仅个别线粒体水肿（略）
胎盘滋养细胞凋亡计数比较:每个样本随机计数（5000倍）5个视野观察，见表1。
表1 各组胎盘滋养细胞凋亡计数比较（略）
注:治疗组、对照组与模型组、空白组比较， * P<0.01，差异有非常显著性
3 讨论
大鼠胎盘形态属盘状胎盘（discoid placenta），呈圆形或椭圆形。在母体/绒毛膜组织交错程度方面，人类为小叶型，大鼠属迷路型胎盘，子宫内膜与绒毛膜组织交错程度最高的应属迷路型胎盘（labyrinthine type of placenta）。胎盘绒毛膜的滋养层细胞形成迷路样孔状网状结构，浸润在母体血液当中。迷路型胎盘组织与母体血液交换面积最大，母体与胎儿的物质交换效率最高。在胎盘屏障方面，大鼠胎盘为取代式植入，胚泡的滋养层细胞首先使子宫内膜的上皮细胞脱落，然后取而代之开始植入过程。大鼠母体侧最后一道屏障即血管内皮细胞被胎盘滋养细胞侵蚀后，胎盘的绒毛小叶就直接浸润在母体血液当中，母体血和胎儿血之间的组织屏障则完全由胎儿侧三层组织组成，分为绒毛的滋养层细胞、结缔组织及血管内皮细胞。此类被称为血液绒毛膜型胎盘。此与灵长类及人类相同。即鼠型胎盘为血液/三层滋养层细胞:合体滋养细胞上下方都有一层细胞滋养层。在母体/胎儿血流关系方面，迷路型胎盘胎儿侧微循环血管之间相互连接形成网状，母体血液充润其中。血液流动呈对流式，物质交换最高，血管虽然平行，但血流方向相反。胎儿胎盘比例大，可达20∶1。
结果表明:细胞凋亡空白组与模型组比较差异有非常显著性（P<0.01），说明一氧化氮合成阻滞模型胎盘滋养细胞存在异常凋亡，可能是胎盘供血不足引起的妊娠并发症如妊高征、胎儿生长迟缓的病理机制之一。这种机制可能是导致小胎盘或胎盘植入不足或浅表着床的原因之一。黄芪、丹参对模型同步进行干预性治疗，胎盘滋养细胞凋亡与空白组相比，差异无显著性（P>0.05），治疗组、对照组与模型组比较，差异有非常显著性（P<0.01）。已知胎盘植入不足或胎盘浅表着床是诱发妊娠高血压综合征、胎儿宫内生长迟缓的关键机制之一［1～3］ ，上述比较说明黄芪丹参复方成分可以提高细胞活力，阻抑滋养细胞异常凋亡，防止胎盘浅表着床，有利于滋养细胞的植入，从而达到提高胎盘血液供应的目的。空白组之外各组均不同程度存在滋养细胞水肿，线粒体肿胀、空泡化等现象，说明一氧化氮合成阻滞可能通过导致胎盘供血不足，引起滋养细胞缺血缺氧，药物治疗有一定效果，但与正常妊娠仍然存在差距。模型组滋养细胞表面绒毛稀少，治疗组与对照药物组绒毛丰富，几乎接近空白组，绒毛是胎盘植入、母胎血液、物质交换的重要场所，一氧化氮合成阻滞导致内源性一氧化氮合成不足，其与绒毛减少的关系仍需进一步的深入研究。
光镜低倍形态观察表明:正常大鼠的子宫—胎盘各层结构清晰，比例适中，子宫螺旋小动脉经历妊娠生理性改变，管壁变薄，管腔变大，以保证胎儿有足够的血液供应;一氧化氮合成阻滞模型这种变化仅限于蜕膜层的部分血管分支，而子宫肌层与蜕膜其他部分血管则发生急性动脉粥样硬化，表现为内膜细胞脂肪变及血管壁坏死，血管管腔狭窄，明显地增加了胎盘床末梢血管阻力，影响母体血流对胎儿的供应;有研究表明，重度PIH胎盘绒毛合体结节及细胞滋养细胞有增多趋势，滋养细胞基膜增厚的绒毛及纤维蛋白样坏死绒毛亦增多，可直接阻碍母胎间气血交换。而绒毛面积减少使母—胎之间的气血交换面积减少，气血交换阻碍增加，严重影响胎儿的宫内生长发育。本实验结果表明:造模后大鼠胎盘呈现瘀血状态，绒毛结构模糊、萎缩，部分绒毛纤维素化，绒毛面积减少，绒毛间隙加宽，底蜕膜片状坏死;经黄芪丹参复方组分治疗后，绒毛面积显著增加，间隙减少，底蜕膜增厚，血管清晰，管腔大，无充血表现。由此提示黄芪丹参复方组分能够促进妊高征模型大鼠胎盘的修复，改善胎盘床血管，从而达到治疗PIH的目的，其可能机制是抑制了TNF-α的释放，保证了血管内皮细胞的完整［4］ 。以益气化瘀立法的黄芪丹参复方组分二者配伍，使气血得补，瘀血得化，气血顺畅，胎有所养，对PIH表现的高血压、水肿、蛋白尿，具有长胎、降压、利水，提高红细胞变形能力，改善微循环，缓解血管痉挛，提高子宫—胎盘—胎儿血供的作用。从现代医学理论及临床验证来看，本法具有一定的理论根据。基于PIH是妊娠期的特有疾病，如能提出一种有效的预防措施，将为妊娠疾病的防治开辟新的篇章。
参考文献
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（编辑新 竹）
* 基金项目:国家自然科学基金（C30000225），国家中医药管理局基础研究项目（2000-J-T-17），湖南省教委青年项目（01B014）资助
作者单位:410007长沙湖南中医学院中西医结合系