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【摘要】 目的 探讨克隆东亚钳蝎Na + 通道毒素基因，并对其进行研究分析。 方法 参考已知蝎Na + 通道毒素基因设计引物，利用RT-PCR方法，以东亚钳蝎毒腺的mRNA为模板进行PCR克隆。利用生物软件和生物信息网络分析该基因及其编码的蛋白质。 结果 得到一个新的Na + 通道毒素基因BmK-A。 结论 分析编码蛋白质的特点，认为BmK-A为一个Na + 通道α-毒素基因。
关键词 东亚钳蝎 RT-PCR Na + 通道毒素
Molecular cloning and analysis of a novel gene of Buthus martensii Karsch
Gu Shaoju，Qin Yuan，Kong Tianhan
Guangzhou Research Institute of Snake Venom，Guangzhou Medical College，Guangzhou510182.
【Abstract】 Objective To clone and analyse a novel Na + channel toxins gene from Buthus martensii Karsch（BMK）.Methods Based on the known sequence of Na + channel toxins gene of the scorpion designs primers.The mRNA from the venom gland of BMK was templates，RT-PCR was used to clone gene.Biology softwares and Bioin-formatic network were used to analyse the gene and its coded protein.Results A novel gene was cloned by PCR method.Conclusion Analysing its coding protein，consider that it is a novel Na + channel toxins gene and its coded protein isα-type toxins.
Key words Buthus martensii Karsch RT-PCR sodium ion-channel toxin
东亚钳蝎是我国的主要蝎种，广泛分布于中国西北部、蒙古及韩国，毒性温和，毒液中富含生物活性多肽物质，有极大的药用价值。几千年前，蝎煎剂就被用来治疗中风等疾病，近年来又发现其含有抗癌多肽 ［1，2］ 、抗癫痫肽、抗菌肽等。其中主要药效部位在蝎毒，蝎的毒液主要成分是具有生物活性的多肽，即蝎毒素。据估计，蝎毒素大约有100000种，已发现的只占0.02%，大多数属离子通道阻滞剂，特异识别并结合细胞膜上的Na + 、K + 、Cl - 、Ca 2+ 等离子通道，调节离子通道的启闭或阻断离子的通过 ［3～6］ 。目前，对离子通道疾病的深入研究发现除了很多遗传疾病（如癫痫等）与离子通道相关外，恶性肿瘤的生长、转移等都与离子通道密切相关，如Cl - 通道变异引起的脑胶质瘤、L型钙通道变异与结肠肿瘤相关等 ［7］ 。因此，除了离子通道相关药可用于治疗神经性疾病，进一步深入研究其对细胞膜离子通道的作用、对细胞周期调控的影响及与肿瘤细胞的联系等具有重要意义。为开发以离子通道作为靶点的新型抗肿瘤药物提供一个新的研究方向。
蝎毒Na + 通道毒素种类较多，保守性较好，而且蝎Na + 通道毒素三维结构属于典型的胱氨酸稳定的α/β折叠。这些特性使得蝎Na + 通道毒素作为分子探针广泛用于VGSC S 结构和功能的研究。然而，目前从天然蝎毒中分离出单一Na + 通道毒素组分，在质和量上都非常困难，因此，克隆毒素基因，并通过基因工程的方式来表达某一蛋白，成为首选方案。克隆Na + 通道毒素基因，为后期表达获得大量的活性蛋白提供材料，同时为通过定点突变的方法研究Na + 通道毒素多肽的作用机制提供基础。本研究克隆的基因BmK-A经过翻译，分析其结构发现，BmK-A为一全新Na + 通道毒素基因，且为Na + 通道毒素分类中的α-毒素，经查阅在NCBI基因Bank中未发现相同基因。
1 材料与方法
1.1 材料 东亚钳蝎来自广州农村，提取蝎毒腺的组织RNA试剂盒购自赛百胜公司;RT-PCR试剂盒购自赛百胜;凝胶回收用试剂盒（E.Z.N.A Gel Extraction kit）购自OMEGA BIOTEK公司。其他生化试剂和酶购自Promage和TAKARA公司。
1.2 方法
1.2.1 设计PCR引物 上引物AGTTGAATTCGTWMRN GATGSTTAYATTG;下引物CATTGCGGCCGCTTAWBNRCSATK GCATTTTCC。以IUB（International Union of Biochemistry）标准的兼并碱基代码M:（A/C）R:（A/G）W:（A/T）S:（C/G）Y:（C/T）K:（G/T）V:（A/C/G）H:（A/C/T）D:（A/G/T）B:（C/G/T）N:（A/G/C/T）。利用兼并碱基在上引物设计了一个限制性内切酶EcoRI的酶切位点，下引物设计一个NotI酶切位点。
1.2.2 一步法RT-PCR扩增 反应流程和条件42℃1hr.（反转录cDNA）;94℃5min（灭活反转录酶），62℃2min;72℃3min一个循环。94℃1min，62℃2min;72℃3min，循环30次。94℃1min，62℃2min;72℃延伸10min反应结束。8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
1.2.3 回收扩增片断 连接T载体。
1.2.4 测序 送博亚公司测序。
2 结果
2.1 东亚钳蝎毒腺RNA提取 提取了适量东亚钳蝎毒腺RNA。
2.2 RT-PCR扩增结果 见图1。
图1 RT-PCR扩增结果（略）
（0.8%琼脂糖电泳）
2.3 测序结果 将扩增片段回收，连接到T载体，经上海博亚公司测序，得到一个223bp长度的基因片段。对这个基因片段进行翻译，编码的氨基酸序列，见图2。
2.4 与BmK-A相关氨基酸的clustal w多序列比较 BmK-A编码的氨基酸在NCBI网络搜索，然后对最相关的序列进一步做clustal w多序列比较，结果见图3。
图2 BMK-A基因cDNA序列及其对应的氨基酸序列（略）
图3 与BmK-A相关的8个氨基酸的clustal w多序列比较（略）
3 讨论
BmK-A基因经过双向测序，确保其序列测定准确。基因序列及其编码的氨基酸序列在C端、N端和中间均与其他序列不同，经互联网NCBI查阅认为BmK-A为一个新的蝎Na + 通道毒素基因。
基因BmK-A编码69个氨基酸，含有8个胱胺酸，即有4对二硫键，第9位残基为Pro，分子量为7773.52，等电点为7.48。总结以上基因BmK-A编码氨基酸的特点，认为基因BmK-A编码Na + 通道α-毒素，且为α-毒素中一个分支:α样毒素。该毒素作用于哺乳动物和昆虫的Na + 通道，使其失活，进而抑制细胞Na + 电流 ［8］ 。
通过对BmK-A基因编码的蛋白质进行多序列比较，发现该基因保守性非常高;同时多个Na + 通道毒素均比较保守（见图3中下面打*的氨基酸残基）。可以看出Na + 毒素具有趋异进化的趋势，故认为东亚钳蝎毒素是由多种同源性极高的毒素组成的家族。BmK-A基因的克隆为利用基因工程体外表达蝎Na + 通道毒素奠定基础，同时为进一步研究该毒素的结构学、神经生物学提供研究基础 ［9，10］ 。
参考文献
1 孔天翰，董伟华，周永安，等.3种蝎毒抗癌多肽制剂抑制小鼠肝癌及增强免疫的作用比较.河南医科大学学报，1999，34（1）:55-58.
2 董伟华，孔天翰，韩雪飞，等.蝎毒抗癌多肽对4种人肿瘤细胞系的作用.河南医科大学学报，1999，34（1）:52-55.
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5 肖帆，曹志贱，吕猛，等.一种新的蝎毒素的基因组结构及分析.遗传学报，2003，30（7）:663-667.
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8 朱顺义，曹志贱，李文鑫.蝎Na + 通道毒素的结构及功能研究进展.生理科学进展，2002，33（2）:176-178.
9 雷留根，孔天翰，韩雪飞.纯化蝎毒IV（SVCIV）的中枢镇痛作用.针刺研究，1994，19（3，4）:110-113.
10 孔天翰，董伟华，王永奎，等.蝎毒抗癌多肽对CNE-2Z细胞膜电位的影响.河南医科大学学报，2001，36（6）:653-655.
（编辑晓 青）
* 基金项目:广东省攻关课题（编号:2003A3080303）;广州医学院课题（编号:0207-038109）
作者单位:510182广州医学院广州蛇毒研究所（△ 通讯作者）