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【摘要】 目的 研究呋喃唑酮对雄性大鼠睾丸细胞的药理作用。方法 按不同时间间隔，每日给大鼠灌喂1次呋喃唑酮，然后取大鼠睾丸进行病理细胞分析。结果 呋喃唑酮对睾丸细胞有特异性的损伤。结论 呋喃唑酮使用的剂量和时间有量效关系。
【关键词】 呋喃唑酮；大鼠；睾丸
呋喃唑酮［nitrofurazolidone,NFZ,N-（5-nitro-2-furfuylidene）-3aminiooxazolin-2-one］属于硝基呋喃类化合物，是一种廉价的广谱抗生素，主要适用于治疗菌痢、腹泻［1］。已知呋喃唑酮对人体的毒副作用包括恶心、呕吐、厌食、周围神经炎等，以及使先天性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏者易出现溶血性贫血［2］。相对的，硝酸呋喃类抗生素中的其他成员如呋喃妥因、呋喃西林等对人体的毒副作用还要大于呋喃唑酮。为进一步探讨呋喃唑酮对细胞的毒副作用机制，我们拟定了呋喃唑酮对大鼠睾丸的作用机制的研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 成年雄性Wistar大鼠购于吉林大学动物饲养室，呋喃唑酮标准品由药检所提供。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 成年雄性Wistar大鼠共14只，每只重约250g，常规喂养。将呋喃唑酮按20mg/ml，用生理盐水溶解，其中12只按100mg/1g体重，每日灌喂1次。分别与开始用药后的12、24、48、72、96h随机将2只Wistar大鼠用乙醚麻醉后断头，低温无菌条件下分离睾丸组织，大鼠的左侧睾丸，经甲醛固定、石蜡包埋、切片，用于原位末端标记检测，右侧组织迅速剥离包膜及脂肪组织，用灭菌的100目铜网将曲细精管磨碎，加入1ml冷PBS，再用100目尼龙网制成单细胞悬液，用于梯度电泳鉴定。留下2只每日灌服生理盐水，并于96h后随用药Wistar大鼠一起麻醉后断头，取组织进行2种检测。
1.3 梯状电泳鉴定 （1）细胞用冷PBS洗2次，每次于1000转/min离心5min；（2）每106个细胞中，加入20℃反应2h冷裂液（50mM Tris-HCl,pH 7.5,20mM EDTA,1%NP-40）轻轻震荡10s后，1600转/min，离心5min；（3）上清加入1%SDS，加入RnaseA至5μg/μl，56℃反应2h；（4）加入蛋白酶K至2.5μg/μl，37℃反应3h；（5）加入1/2体积的10M乙酸铵，2.5倍体积的预冷无水乙醇，室温放置10min；（6）10000转/min，4℃离心10min，用75%乙醇洗沉淀2次，空气干燥，重溶于20μl TE中；（7）取10μl电泳，电泳条件：0.5×TBE电泳缓冲液（45mM Tris-borate,2mM EDTA）,室温、恒压50V电泳1.5h后，加入2μg/μl EB中染色，去离子水中脱色1h至过夜，观察、拍照留下试验结果。
1.4 原位末端标记检测 （1）实验用玻片预选用0.01%多聚赖氨酸或其他防脱片石蜡切片：用10%中性缓冲福尔马林4℃过夜固定，较低温度（＜60℃）下浸蜡、包埋、切片，检测前切片常规脱蜡入水；（2）用0.01M PBS（pH 7.4）稀释蛋白酶K处理过样品片上室温放置10～30min；（3）室温下PBS洗样品3min/次，重复3次；(4)用4%多聚醛PBS室温下固定5min；（5）双蒸水洗样品3min/次重复3次；（6）样品片上加标记缓冲液，50μl/片，室温放置15min；（7）将TdT及Biotion-11-Dutp经离心机离心，分别取2μl加入16μl标记缓冲液中，在混匀器上混匀；（8）甩掉样品片上标记缓冲液，然后加上述已混匀的混合液至样品上，20μl/片，37℃于温盒中标记60min；（9）将20×SSC溶液稀释10倍，然后将标记后的样品浸泡于2×SSC中，室温放置15min；（10）PBS洗样品片，3min/次，重复3次；（11）样品片放入新鲜配制的0.3%过氧化氢-甲醇中，室温放置15min，PBS洗样品片3min/次，重复3次；（12）样品片加上封闭液50μl/片，室温放置30min，然后甩掉封闭液；（13）以封闭液按1：50配制Avidin-HRP为工作液；50μl/片加于样品片上，37℃湿盒反应60min；（14）PBS洗样品片，3min/次，重复3次；（15）DAB显色液显色；（16）苏木精复染；（17）常规封片、镜下观察。
2 结果
取Wistar大鼠的睾丸肉眼进行观察：实验组按设计时间喂药的睾丸与正常喂养灌服生理盐水相比较未见异常形状的改变。在光学显微镜下观察：实验组的Wistar大鼠的睾丸基本结构即曲细精管、睾丸的间质、直精小管、睾丸网与正常大鼠即空白对照大鼠相比未见异常。提取用药后不同时间段大鼠睾丸组织DNA，进行电泳分析。结果表明，用药后24h出现梯状带，最小约180bp，到8h梯状带最为典型，表明基因组DNA被特异的核酸内切酶水解。
为进一步支持以上结论，同时对给药大鼠的睾丸组织切片进行了原位末端断裂标记检测，结果与DNA凝胶电泳结果一致，大鼠在100mg/（kg·d)条件下摄入呋喃唑酮后24h，可以观察到生精细胞凋亡，以次级精母细胞及精子细胞为主，并有少数支持细胞受累。培养的细胞中加入呋喃唑酮后，约2h后即可观察到细胞收缩，折光度下降，聚集成团，部分细胞形成凋亡小体脱落，加药后4h，细胞全部死亡，而未加药组细胞可连续培养18h。
由以上可知，呋喃唑酮及其衍生物通过诱导睾丸细胞凋亡而具有特异的睾丸损伤作用。
3 讨论
呋喃唑酮被广泛应用于临床，并作为禽兽饲料添加剂。因此，必须重视呋喃唑酮对人体可能产生的直接或间接的毒副作用。动物实验表明［3］：一定剂量的呋喃唑酮可以特异性杀伤成年雄性动物的睾丸细胞，而对其他组织器官的损伤很小。
【参考文献】
1 Malekzadeh R, Ansari R,Vahedi H,et al.Furazolidone versus metronidazole in quadruple therapy for eradication of Helicobacter pylori in duodenal ulcer disease. Aliment Pharmacol Ther,2000,14:299-303.
2 Carcelen A, Chirinos J,Yi A.Furazolidone and chloramphenicol for treatment of typhoid fever.Scand J Gastroenterol Suppl,1989，169:19-23.
3 Smith DJ Paulson GD,Larsen GL.Distribution of radiocarbon after intramammary,intrauterine or ocular treatment of lactating cows with carbon14nitrofurazone.J Dairy Sci，1998，81:979-988.
作者单位： 130041 吉林长春，吉林省计划生育科研所
(编辑：苜 紫)