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【摘要】 目的 探讨银环蛇毒中毒检测中不同材料与不同方法的优缺点。方法 采用双向免疫扩散法与间接ELISA法对银环蛇毒中毒的人与动物的不同标本进行检测。结果 双向免疫扩散法死者伤口皮肤组织液、死者心脏血清、死小猪伤口皮肤组织液及死小猪血清标本均未见免疫沉淀带；ELISA法测标本均为阳性。结论 银环蛇毒中毒检测中伤口皮肤组织液和血液都是合适的材料；双向免疫扩散法的检出率较低，而ELISA法则是一种较好的检测方法。
【关键词】 银环蛇毒；免疫电泳法；酶联免疫吸附法
Study on methodology for detection of banded krait venom
QIN Yuan，GU Shao-ju.Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182，China
［Abstract］ Objective To compare the advantages and disadvantages of different samples and different methods in detection for banded krait venom.Methods Double immunodiffusion and enzymelinked immunosorbent assay were used as the methods to detect different samples of people and animal who were bit by banded krait.Results In double immunodiffusion the samples were all negative；with ELISA the samples of wound tissue liquid and blood were all positive.Conclusion Wound tissue liquid and blood are both fitting samples in detection for banded krait venom；double immunodiffusion isn’t adapt to detect banded krait biting patient，but ELISA is an good detection method.
［Key words］ banded krait venom；immunoelectrophoresis；enzymelinked immunsorbent assay
毒蛇咬伤为比较常见的急症之一，近年来随着人民生活水平的提高，食蛇、用蛇的人日益增多，毒蛇咬伤病例逐年大幅度增加。蛇伤的发生具有突发性，且病情危急、病程进展快，常常引起人体脏器的损伤和衰竭，轻者致肢体伤残、重者则引起死亡［1］。而今蛇伤的诊断主要依靠病史和临床表现，因为有重叠特征，要判断所咬伤的蛇的种类很困难，仅仅从临床表现判断，有时会发生误判，导致患者不能及时得到治疗，蛇伤快速诊断方法对于临床蛇伤的正确诊治具有极为重要的意义［2］。同时近年蛇毒中毒的案件也时有发生，判断是否为蛇毒中毒，为何种蛇毒中毒，使得蛇毒检验具有更广泛的意义［3］。
银环蛇毒素是从银环蛇的毒腺中分泌出来的毒液，新鲜毒液呈灰白色、黏稠、具有特殊的腥味。银环蛇一次排毒量约4.6 mg，人致死量1 mg干毒，是世界十大毒蛇之一［4］。由于其排毒量较少，增加了其检测的难度。笔者报告银环蛇咬死者1例，同时用小猪作对照采用不同方法检测不同的标本，以探讨银环蛇毒中毒的检测不同材料与方法的优缺点。
1 材料与方法
1.1 参考标准蛇毒 准确称取本所精制银环蛇粗毒，浓度梯度：0.25 ng/ml、1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml。
1.2 抗原标本 银环蛇咬死者伤口皮肤组织液，死者心脏血清；银环蛇咬死小猪伤口皮肤组织液，死小猪血清。
1.3 阴性标本 正常人血清，死者周边皮肤组织液，正常猪血清，小猪周边皮肤组织液。
1.4 方法
1.4.1 双向免疫扩散法 用pH 8.6的巴比妥钠缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，厚度2～3 mm，自然冷却后打孔（3 mm），孔距10 mm，挑出孔内琼脂，在火焰上缓缓加热以封底，中心孔加抗银环蛇血清，周围孔加蛇毒及被检抗原，每孔加液量均为15 L，置37 ℃水浴箱24～48 h，观察结果。标准阳性血清和被检抗原之间出现白色沉淀线者为阳性，不出现沉淀线者为阴性。
1.4.2 间接ELISA法 以标准蛇毒及抗原标本包被96孔酶标板，37 ℃温育2 h，取出后以pH 7.4 PBS－Tween 20 （0.05 %） 缓冲液洗板3次；再以含3 % BSA 的PBS－Tween 20 （0.01 %） 封闭液每孔100 μl封闭酶标板，37 ℃温育90 min，洗板3次；马抗银环蛇毒抗体配成浓度为10 μg/ml的工作液，以0.1 ml/孔加入到上述酶标板中，37 ℃温育30 min，PBS洗板3次；加入兔抗马IgG－HRP （按1∶5000稀释）100 μl，37 ℃温育1 h；洗涤后每孔加40%邻苯二胺底物溶液0.1 ml，37 ℃避光孵育10 min，每孔用100 μl 4M H2SO4 终止反应；490 nm测光吸收值。2 结果
2.1 双向免疫扩散法 免疫电泳法：观察48 h内免疫电泳扩散结果：蛇毒抗原可见免疫沉淀带；死者伤口皮肤组织液、死者心脏血清、死小猪伤口皮肤组织液及死小猪血清均未见免疫沉淀带（图1）。
2.2 间接ELISA法 蛇毒抗原0.25～250 ng/ml浓度的吸光值呈明显的浓度梯度。死者伤口皮肤组织液、死者心脏血清、死小猪伤口皮肤组织液及死小猪血清均为阳性（表1、表2）。表1 标准蛇毒的间接ELISA法的吸光度均值标准蛇毒梯度表2 不同标本的间接ELISA法的吸光度均值
3 讨论
蛇毒是一类含有多种生物活性蛋白和多肽的混合物，它的成分复杂，要从可疑含蛇毒的生物性样本中分离、检测某种蛇毒蛋白困难很大，但由于蛇毒蛋白具有种属特异性，因此可根据抗原抗体反应的原理，用免疫学方法利用种属特异性抗体检测样本中相应的蛇毒抗原［5］。
人们一般用家兔作为蛇咬伤的实验动物，但其体重及体表与人相差较远，笔者选用小猪作为实验动物，采用蛇咬小猪而更准确的模拟了蛇咬人的过程，从而获得更准确的样品标本。从表2中数据可知银环蛇毒中毒伤口皮肤组织液检出值较高，血液次之，两者都是蛇毒中毒检验中合适的材料。对于银环蛇咬致死的案件，死者的伤口皮肤组织液比血液更易采集。而患者则可以通过血液监测蛇毒的含量变化，用于指导临床治疗。
双向免疫扩散法的设备简单、操作方便，但灵敏度较低；而银环蛇排毒量很少，在血液中通常只达到纳克级，使其不能对蛇伤做出有效诊断，且由于检测时间过长，不能及时指导临床治疗，所以双向免疫扩散法不适用于银环蛇毒中毒患者的检验。但由于其假阳性率低，对于蛇毒致死案件的鉴定有一定意义。
而ELISA法则是一种较好的检测方法，其优点在于:（1）灵敏度高，大部分蛇咬伤的病例中，蛇毒的浓度一般在纳克级范围内，所以要求检测方法必须非常灵敏。ELISA法的灵敏度可达到纳克甚至皮克水平；（2）快速性；（3）方便性，可直接采用中毒者的血液、伤口组织液进行检测。同时微量ELISA方法对对蛇伤的免疫学和流行病学的研究具有重要意义。然而非特异性反应仍是干扰ELISA检测准确性的主要因素。
随着生物传感器的快速发展，其体积的小型化、检测时间缩短、灵敏度提高使其成为最适于在野外使用的蛇毒检测方法。Rogers等［6］将烟碱型乙酰胆碱受体固定于光纤上，制成烟碱型乙酰胆碱受体生物传感器，利用其可以和金环蛇毒特异结合的特性，检测蛇毒的浓度。我们正研究以制备的鸡卵黄抗蛇毒抗体为基础，研制蛇伤快速诊断蛋白传感芯片。
【参考文献】
1 谭杜勋.南方毒蛇伤的流行病学特点与急诊救治.中国急救医学，1999，19（3）:181.
2 余清声，赖振添.蛇伤急救的基础与临床.通用危重病急救医学.天津：天津科技翻译出社，2001，1360-1378.
3 李峰，夏为民，兰秀康.注射银环蛇毒杀人1例.法医学杂志，2004，20（2）:127.
4 覃公平.中国毒蛇学.南宁:广西科学技术出版社，1995，776-780.
5 Bhatti AR，Wong JP，Siddiqui YM，et al.A sensitive fluorogenic enzyme linked immunosorbent assay for the detection of Vipera russelli venom.Nat Toxins，1993，1（5） :277-282.
6 Rogers KR，Valdes JJ，Eldefrawi ME.Effects of receptor concentration，media pH and storage on nicotinic receptortransmitted signal in a fiberoptic biosensor.Biosens Bioelectron，1991，6（1）:1-8.
作者单位：510182 广东广州，广州医学院广州蛇毒研究所