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【摘要】 目的 通过对不同生产厂家试剂盒的国家参考品检测结果，分析国产丙型肝炎抗体酶联免疫试剂（ELISA试剂）的批内稳定性以及批间稳定性对试剂质量的影响。方法 以国家第三代第二批抗-HCV参考品40份阳性血清，40份阴性血清分别对不同试剂多批次不同批号试剂盒进行检定，利用检测数据进行统计分析，对设定“灰区”血清（CUTOFF×15%）范围内同一试剂不同批次所测得OD值，计算其批间CV%值、标准差和标准误。结果 不同国产试剂对Core区、NS3区抗体谱血清漏检情况不同，存在抗体谱漏检错位现象。同一厂家不同批次检测弱阳性临界值血清CV%值较高，“灰区”标本血清检测结果变化较大。结论 建议试剂生产厂家应建立临界值对照血清，以控制“灰区”标本的检测结果，确保试剂的批间稳定性。
【关键词】 肝炎；病毒；酶联免疫；试剂；稳定性
Analysis of grey zone panel detecting by domestic Anti-HCV Kits
YANG Zhen，QI Zi-bai，YU Yang，et al.National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biology Products，Beijing 100050，China
［Abstract］ Objective To investigate the quality of domestic anti-HCV EIA kits and analyse their different batchs stability.Methods Forty positive sera and 40 negative sera were detected by 17 domestic anti-HCV EIA and 3 imported anti-HCV EIA kits.The suspicious samples were confirmed with RIBA and PCR，and we calculated CV%，Stdeva and Steyx of five batchs kits of five domestic and one imported manufactures detecting grey zone panel in succession.Results Almost the whole domestic manufactures had false positive and negative report.These results were distinct.The results of domestic EIA Kits CV%，Stdeva and Steyx were comparely higher than import’s.Conclusion We suggest that the domestic manufactures must establish the system of critical serum control.
［Key words］ hepatitis;virus;veagent;stability
中国药品生物制品检定所从1994年开始建立国家参考品，经多年努力，国产试剂质量有了很大提高。但在实际应用中，仍存在试剂检测结果不稳定等问题，下面笔者利用第三代第二批抗-HCV诊断试剂国家参考品检验了17个国内生产厂家和三个国外生产厂家的试剂，并对检验结果进行初步分析。
1 材料与方法
1.1 试剂 （1）参加国家抗-HCV诊断试剂批批检定的国产抗-HCV诊断试剂17家95批。（2）参加国家抗-HCV诊断试剂常规进口检定的国外抗-HCV诊断试剂3家9批。（3）抗-HCV确证试剂为美国CHIRON公司免疫印迹确证试剂（RIBA，CHIRON RIBA 3.0）。（4）HCV RNA PCR试剂为河南华美公司、北京肝炎试剂中心、深圳匹基公司等单位提供。
1.2 血清 国家第三代第二批抗-HCV参考品，包括40份特异性阴性血清，40份阳性血清。合格标准为40份特异性阴性血清合格率≥39/40，40份阳性血清符合率为≥38/40，总符合率为≥77/80。
1.3 方法 对抗-HCV EIA国产和进口试剂均严格按其使用说明书进行操作，以国家第三代第二批抗-HCV参考品中的80份血清作为待检样品进行检测，血清检测结果按各试剂使用说明书的判定方法判定。
1.4 仪器 美国BIO-RAD酶标仪，国产1575洗板机。
2 结果
2.1 检测OD值结果 从17个国内厂家与三家国外厂家分别选一批试剂，对国家参考品中易漏检样品检测OD值进行比较，见表1。国产14、15、17号厂家试剂的检出率较高，同时它们试剂的检测临界值也比较高。这些国产试剂和进口主流试剂的差距不大，它们代表我国试剂的发展方向，同时确保了国产试剂在筛检献血员的高质量使用。但部分国产试剂对代表Core区的P2号血清和代表NS3区的P6号血清漏检较多。这与以前的研究一致［1］。同时，有的试剂主要漏检Core区血清，有的试剂主要漏检NS3区血清，可以看出不同国产试剂对漏检血清是不同的，存在抗体谱漏检错位现象。并且可以看出国外a、b试剂的检测临界值远远大于国内部分试剂，同时，它们对临界值弱阳性参考血清的漏检却较少。
2.2 检测CV%值标准差、标准误结果 选5种国产试剂相邻5批次对一份临界值阳性样品检测的CV%值及标准差及标准误结果进行分析，并比较一种国外试剂检测结果，见表2。
可以清楚地看出，对P2号弱阳性血清的5批次检测中，国外一家试剂检测的CV%值，标准差和标表1 17个国内生产厂家和3个国外生产厂家一批试剂检测弱阳性血清结果注：1～17为17个国内生产厂家的试剂，a～c为国外生产厂家产品表2 5种国产试剂相邻5批次对一份临界值样品检测的CV%值及标准差及标准误结果注：3、6、7、8、14为5个国内生产厂家试剂，b为国外生产厂家试剂
准误明显低于国内试剂，而国内试剂变化较大。合并表1、表2可以看出，由于国内试剂临界值普遍偏低，而批间变化造成对同一弱阳性血清不同批次检测结果可能相反。表明对临界值血清的控制，国内试剂存在一定问题。看来，国内试剂对“灰区”样本的检测稳定性还需改进。
2.3 灵敏度、特异性和约登指数的检测结果 对17个国内生产厂家的前5个厂家的其中一批试剂的国家参考品灵敏度、特异性和约登指数的检测结果进行分析，并比较三种国外试剂的灵敏度、特异性和约登指数的检测结果，见表3。 表3 前5个试剂的其中一批试剂国家参考品灵敏度、特异性和约登指数的检测结果注：1～5为国内生产厂家的试剂，a～c为国外生产厂家产品
从表3可以看出，虽然，国内外试剂均可达到国家标准的要求，但国外试剂的约登指数却普遍高于国内试剂。表明国外试剂在批内稳定性方面要好于国内试剂。
3 讨论
笔者从1994年开始建立国家抗-HCV诊断试剂参考品以来，经过近十年的努力，使得抗-HCV EIA国产试剂和进口主流试剂的差距缩小。国产14、15、17号试剂的检出率较高，同时它们试剂的检测临界值也比较高。这些国产试剂和进口主流试剂的差距不大，它们代表我国试剂的发展方向，同时确保了国产试剂在筛检献血员时的高质量使用［2］。但国内部分试剂在质控时，只要求达到国家参考品的最低要求，而忽略了试剂质量的根本提高，造成国内部分试剂质量与国外主流试剂有一定差距［3］。笔者曾研究［4］表明国外试剂对试剂质量的关键技术（如抗原决定簇的表达、抗原包被量、抗原的纯化纯度）要好于国内试剂。还有一点，国外a、b试剂的加样后孵育检测反应时间一般是60 min，但国内17种试剂均≤30 min。有研究表明，延长反应时间，可以提高阳性样品特别是弱阳性样品的检出率。因此，笔者曾提出要适当延长反应时间，在避免非特异反应的同时，以提高阳性样品特别是弱阳性样品的检出率。现在国内部分试剂盒阳性对照血清相对是高值对照血清，建议使用临界值对照血清作为试剂盒中第三个对照品，这样评价所做试验的准确性更高。同时，实验中还发现［5］，国产试剂对NS3、Core区抗体阳性血清漏检存在抗体谱错位现象。有研究认为NS3、Core区抗体出现最早，NS4和NS5区抗体出现较晚。还有研究认为［6］，核心蛋白抗原性较强，刺激机体产生抗体出现早，效价较高且维持时间长，而动态观察NS3和NS4抗体，与治疗效果以及愈合相关性较强。所以，国内试剂必须加强NS3、Core区抗体检测的检出率，减少漏检。
【参考文献】
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2 葛红卫，赵莉华，王鸿捷.国产抗-HCV酶免诊断试剂在血液筛查实验室中的质量评价.第一届全国现代免疫诊断技术学术研讨会论文汇编，2002.
3 Lee SR，Wood CL，Lane M，et al.Increaseed detection of hepatitis C virus infection in commercial plasma donors by a third-generation screening assay.Transfusion，1995，35:845-849.
4 祁自柏，周诚，杨振，等.第三代丙肝试剂国家参考品的研制及初步应用.中国生物制品学杂志，1999，12（2）：103-105.
5 杨振，祁自柏，谷金莲，等.部分国产HCV抗原的质量分析.中国生物制品学杂志，1998，11：162-165.
6 Oti M，Zonaro A，Ravagi L，et al.Hepatitis C virus RNA and antibody response the clinical course of acute hepatitis C infection.Hepatology，1992，16:877-881.
（编辑：陆 华）
作者单位：100050 北京，中国药品生物制品检定所