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【摘要】 小蔓长春花作为一种引进的药用植物品种，其有效成分在治疗和改善脑血管疾病症状方面有良好的疗效。近年来国内外通过不同的手段对其进行了研究和深层次的开发。本文通过查阅近年来对小蔓长春花研究的文献，从其有效成分长春胺药理作用的研究、通过Ri质粒改良植物材料、利用液膜分离技术提高植物材料的提取率、开发长春胺的衍生物及改良药物剂型等方面进行了综合性论述。
【关键词】 小蔓长春花；长春胺；Ri质粒；液膜分离
Observation on offcinal Vinca minor L
SUN Yu-hong,YIN Hong,GAO Yang,et al.Life Science College of Northwestern University,Xi’an 710069,China
［Abstract］ Vinca minor L as a introduction of a variety of medicinal plants, can improve the symptoms of cerebral vascular disease. Its active ingredient Vincamine has become the focus of research. Through access to a recent study of literature about Vinca minor L, This article discusses the following aspects: the pharmacological effects about vincamine; use of Ri plasmid to improve plant material;application of emulsion liquid membrane to increase the rate of extraction of plant material;the development of the vincamine-derivatives.
［Key words］ Vinca minor L;vincamine；Ri plasmid；emulsion liquid membrane
小蔓长春花（Vinca minor L）为夹竹桃科多年生草本植物，原产于欧洲东南部、中部和中亚地区。小蔓长春花喜温暖气候，平均气温在16 ℃～26 ℃时最适宜植株生长。1953年，Schlittlery从该植物中分离得到抗血栓药长春胺（vincamine）［1］。
随着研究的深入，陆续从该植物内提取出阿朴长春胺（apovincamine）等结构类似生物碱。现在长春胺和长春胺衍生物脱水长春胺乙酯（ethyl apovincamine-22-oate）即长春西丁，已经广泛地用于治疗脑血管病变引起的各种症状如偏瘫、失语症和老年性脑退化等。
随着物质生活水平的不断提高，脑血管疾病和心血管疾病成为威胁人类健康的两大杀手，而长春胺类化合物所具有的独特的药理作用，成为缓解和治疗脑血管疾病的一线药物，对长春胺类药物的需求日益增加，促使人们从多个角度对小蔓长春花的有效成分进行了研究。
1 小蔓长春花有效成分长春胺的药理作用研究
长春胺是小蔓长春花中主要的活性物质，能透过血脑屏障，使病变区脑组织维持和恢复葡萄糖的氧化分解代谢，使乳酸的产生和二氧化碳的释放恢复正常，从而扩张脑小血管，改善脑循环；对正常脑组织以及患者脑组织的正常脑区的血流无明显影响，也不影响全身血液循环；此外还有轻微的镇静作用［2］。
最近的研究还表明，长春胺还有其他方面的药理特性：如增加脑血流；促进大脑对葡萄糖和氧的摄取和利用，增加ATP，减少缺氧缺血时乳酸的生成；防止脑细胞中毒死亡；减轻脑缺氧的损害，保护神经元；增强多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素对神经的功能；防止脑、肝脏、肌肉组织和其他部位的缺血性损害；促进血管舒张，改善血液循环，但对外周的血流影响极小［3］。综合看来，长春胺能够有效地改善脑内微环境，在治疗间歇性脑供血不足、脑血管痉挛、脑动脉内膜炎等疾病上具有较好的疗效［4］。
由于长春胺具有扩张血管以及改善脑内血液循环的作用，因而可改善高血压患者的神经系统症状。脑动脉粥样硬化导致的中风和精神状态低下代表了神经和精神疾病中的一大类疾病。中风病例中许多是由于脑血管栓塞所引起的。栓塞造成血流障碍，进而引起脑代谢障碍，甚至产生局部脑组织坏死，因此迫切需要增加脑血流量，而长春胺正适于这方面的要求。
长春胺降压效果舒缓。临床应用于高血压患者的治疗,每天口服5～20 mg，共3～8个月,无任何不良反应，甚至一次剂量达100 mg也无不良反应。其特点为降压作用并不突出，而主观感觉明显改善。33份不同地区临床试用报告的综合分析表明,75 %的脑血管疾病和脑功能受损患者在使用长春胺后症状获得改善，没有任何恶化的情况发生，也无明显的不良反应。在1 481例中只有28例反映有胃肠不适。据此认为,可以长时间的每天口服长春胺60 mg［5］。
2 利用生物技术手段提高小蔓长春花中长春胺的含量
根瘤菌属中的农杆菌（Agrobacterium）与植物的关系研究已久。尤其是含有Ri质粒的发根农杆菌（A.rhizogenes），它在感染植物后，在植物的伤口部位诱发产生毛状根（hairy root）。毛状根在无激素的培养基上，可迅速繁殖，可以利用毛状根的这种特点生产植物的次级代谢物，提高植物有效成分的生产效率。如黄遵锡等［6］利用该技术提高红豆杉中紫杉醇的产量，刘伟华等［7］利用发根农杆菌转化龙胆再生植株提高龙胆苦苷含量。
在发根农杆菌中一般存在三种质粒：pArA4a、pArA4b、pArA4c。黄瓜碱型质粒pRi1724［8］是镰田在日本千叶县“密伦”（哈密瓜的一个类型）毛状根中发现的。该质粒只有单一的T-DNA，具有合成黄瓜碱合成酶基因。该类型质粒致病性弱，感染时可用生长激素处理获得毛状根，然后在无激素的MS培养基上培养，毛状根可以迅速的增殖。
Tanaka等［9］采用二元载体法将质粒pBI121（具有NPTⅡ基因和GUS基因）通过电穿孔引入发根农杆菌DC-AR2（含有黄瓜碱型质粒pRi1724）中，将在LB培养基培养36 h的菌液与处理得到的小蔓长春花叶肉细胞原生质体在含1%琼脂的培养基上,光照培养3 d后，转入含有500 μg/ml青霉素钠和500 μg/ml 万古霉素的MS培养基培养，利用抗生素除去毛状根中的发根农杆菌，将无菌的新生毛状根在低盐White培养基中25 ℃下暗培养，用含有50 μg/ml卡那霉素的MS培养基筛选有pBI121转录活性的毛状根，利用冠瘿碱检测（Opine assay）证明该毛状根是Ri T-DNA转化根。
他们还发现，Ri质粒感染的小蔓长春花产生的毛状根具有pBI121所携带外源基因的活性，在MS培养基上具有高增殖率。毛状根分化后，显示出与普通小蔓长春花不同的表型特征，如具有较高的侧出分枝率，不定芽的伸长百分率是普通小蔓长春花的2.5倍，顶端优势较普通植株有所减弱［9］，而且Tanaka等［10］还发现由毛状根离体培养分化得到的植株叶部长春胺含量是普通植株的两倍。这些都提示利用pRi质粒感染小蔓长春花所得到的毛状根，进行分化后得到的离体植株是很好的获得长春胺的植物材料，这种办法也是便捷、高效的。
3 利用现代分离技术提高小蔓长春花植物材料的提取效率
传统方法从植物材料中提取生物碱，要采取酸化后溶出，碱化后有机萃取等多个步骤，在多个容器中进行，有效成分的耗损比较大，而且酸化后和碱化后的废液造成环境污染。
液膜分离技术是用液膜模拟生物膜的结构,通常由膜溶剂、表面活性剂和流动载体组成。它利用选择透过性原理,以膜两侧的溶质化学浓度差为传质动力,使料液中待分离溶质在膜内侧富集浓缩,分离待分离物质。
按构型和操作方式的不同,液膜主要分为乳化液膜（emulsion liquid membrane, ELM） 和支撑液膜（supported liquid membrane, SLM）［11］ 。其中乳化液膜分离技术是将含有表面活性剂和膜溶剂的油相和水相（内水相）置于容器中，在高速搅拌下制成油包水型乳状液，再将此乳状液分散到另一种水溶液（第三相）中。在乳珠与第三相间有巨大的接触面积，同时每个乳珠内部又包含无数个直径非常小的内水相微滴。这样的分散体系有很快的传质速度。另外，由于内水相的作用，它的分离富集作用不受平衡的影响，打破了萃取过程的平衡。利用乳化液膜提取生物碱的研究，进行的不多，以前只有Yu［12］和Wang等［13］学者利用该技术回收烟叶提取物中尼古丁的文献报道。
小蔓长春花的提取物中，长春胺以游离态（B）和质子化态（BH+）存在，普通提取法利用游离态生物碱易溶于有机溶剂难溶于水的方法，在碱性环境中进行萃取提取。当在pH为4的醋酸盐缓冲液中，长春胺会被质子化以BH+存在，但当在有机环境中，醋酸分子会以非解离状态（H+A-）溶解于有机相中，长春胺分子与非解离的醋酸分子形成一种离子缔合物（BH+A-），这种离子缔合物同样也易溶于有机相中。
利用长春胺的这种特性，Boyadzhiev等［14］设计了由含有小蔓长春花粗提取物的pH 4醋酸盐缓冲液为第三相，有机溶剂为油相，强酸性盐酸溶液为内水相的水包油包水（W/O/W）的乳化液膜系统。在外水相和油相界面上，溶于油相的非解离态的醋酸分子会不断地把长春胺转运进入有机相（BH++ H+A- BH+A-+ H+），在油相内水相的界面上，由于内水相为强酸性的环境，大部分生物碱会和HCl形成中性的复合物B-HCl（BH+A-+HClB-HCl+H+A-），反应后的醋酸分子不溶于强酸性的盐酸溶液中，再次转移到油相中，导致反应的平衡偏向右边，长春胺分子被不断转移入内水相中。
他们还发现，油相外水相的分配系数在不同的有机溶剂为油相材料时，具有不同比值，氯仿/醋酸缓冲液为＞100，二氯乙烷/醋酸缓冲液为0.78，三氯乙烯/醋酸缓冲液为0.78，四氯化碳/醋酸缓冲液为0.75。油相内水相分配系数在不同油相材料，也具有不同数值。据分配系数的定义，分配系数越大，则分离效果越差，经过比较Boyadzhiev等［14］通过实验得出醋酸缓冲液（pH 4）-三氯乙烯（Trichloroethylene）-0.7 mol/L HCl溶液的乳化液膜提取系统可以将粗体物中92.6%的长春胺转移进入内水相，证明了该提取系统是最为有效的。虽然液膜提取技术现在还大多停留在实验室阶段，但随着下游分离破乳术的发展，该技术将来在工业化高效、环境友好提取小蔓长春花活性成分中一定会得到广泛应用。
4 小蔓长春花有效成分长春胺衍生药品的发展
小蔓长春花中的主要提取物长春胺的结构修饰物和其衍生物从改变药理作用、增加其稳定性、靶向治疗等多个角度进行开发，已经形成了一大类以长春胺结构为母体，用于改善脑部循环的药物。
如长春胺的无水乙醇溶液用浓硫酸处理得到的缩水简化物阿普长春胺乙酯（ethyl apovincamine-22-oate），对实验动物静脉给药后，脑血管阻力下降而脑血流量增加，测得的平均动脉血压、总末梢阻力均下降，且作用时间较长。通过实验比较长春胺对照组，在增加脑血流量和降低动脉血压方面，阿普长春胺乙酯比长春胺作用强［15］。
临床上对50例患有脑循环缺血障碍的患者以每天肌注10 mg阿普长春胺乙酯进行脑电图、脑血流图和记忆跟踪监测，1个月后证明脑循环有改善，多数患者症状减轻或消除，说明此药适合于脑缺血循环性疾病的治疗。阿普长春胺乙酯还具有延缓脑衰老、改善记忆力和视觉功能的效果，世界卫生组织将其命名为长春西丁（Vinpocetine），从开发到临床应用，长春西丁已成为治疗老年痴呆的首选药物。
基于长春胺和长春西丁独特的药理作用，通过剂型改造等手段，国外先后推出了CerebroPlexTM 、Memory2000TM等含有长春西丁的复方制剂及IntelectolTM 、VinpocetineRxTM等长春西丁的新剂型。这些产品畅销欧美等国家,用于改善脑功能、延缓衰老、改善各种原因引起的听觉和视觉障碍、增强记忆力、促进智力等,开创了长春胺类药物应用的新领域［16］。
5 长春胺的人工合成
虽然开发快速有效的植物繁殖技术和提取手段，可以极大地降低对小蔓长春花植物材料的需求，而在1964年，首次由Kuehne发现的由色胺（tryptamine）和3-二甲基-3-乙基-甲酰庚二酸（dimethyl-3-ethyl-3-formylpimelate）人工全合成长春胺的报道［17］，则可彻底脱离对植物材料的依赖。陈光旭等［18］人进一步改进，用更易得到的N-（γ-溴丙基）邻苯二甲酰亚胺和丁酰乙酸乙酯为起始合成长春胺中间体1-乙基六氢吲哚喹嗪，虽然还是实验室研究，但随着合成路线的不断改进，将来有望成为长春胺生产的重要方式。
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作者单位：陕西西安，西北大学生命科学学院（△通讯作者）