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【摘要】 目的 评价在试剂中加有5’-磷酸吡哆醛的丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂。方法 利用日立U-3310紫外分光光度计、温度控制仪和磁力搅拌仪，于37℃，340nm波长，速率法，使用加5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂，测试临床标本，观察两种ALT试剂的检测结果相关性。结果 加5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛的ALT试剂测试临床标本结果比较，回归方程为Y=0.8629X-2.4019,R2=0.9602。结论 加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂与未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂有较好的相关性，且加有5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果约高14%。
【关键词】 丙氨酸氨基转移酶;5’-磷酸吡哆醛;相关性
Determination of alanine aminotransferase assay reagent with pyridoxal-5’-phosphoric acid
BAO Jie, ZHANG Zong-bin.Zichuan Region Hospital of Zibo City, Shandong 255100,China
Objective To evaluate alanine aminotransferase assay reagent with pyridoxal-5’-phosphoric acid.Methods ALT was detected with a series of tests on HITACHI U-3310 UV spectrophotometer, spectrophotometer-controller and magnetic stirrer at 281nm and 37℃ according to speed rate method by alanine aminotransferase assay reagent with or without pyridoxal-5’-phosphoric acid.Results As compared the concentrations detected by alanine aminotransferase assay reagent with or without pyridoxal-5’-phosphoric acid, the regression equation was Y=0.8629 X-2.4019, R2=0.9602.Conclusion The relativity between alanine aminotransferase assay reagent with or without pyridoxal-5’-phosphoric acid is well and the concentration detected by alanine aminotransferase assay reagent with pyridoxal-5’-phosphoric acid is higher than the reagent without pyridoxal-5’-phosphoric acid about 14%.
[Key words] alanine aminotransferase; pyridoxal-5’-phosphoric acid; relativity
吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺是维生素B6的三种形式，它们在体内可以互相转化。维生素 B6在体内经磷酸化作用转变为相应的磷酸酯，即维生素B6的辅酶形式：磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺，它们之间也可以相互转变，均为活性型。作为转氨基的辅酶，磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺在氨基酸代谢中非常重要，是氨基酸代谢中的转氨酶及脱羧酶的辅酶，通过两者互变起着传递氨基的作用。血清中的ALT必须在酶和辅酶同时存在时才表现出最大活力，磷酸吡哆醛为其辅酶，在反应中起到传递氨基作用，测定ALT时，加入磷酸吡哆醛可提高酶的活性。本文将讨论在测定血清中丙氨酸氨基转移酶时，在检测试剂中加入5’-磷酸吡哆醛和不加5’-磷酸吡哆醛时两种检测结果的关系。
1 材料与方法
1.1 仪器 日立U-3310紫外分光光度计，日立温度控制仪，日立磁力搅拌仪。日立7180全自动生化分析仪。
1.2 试剂 按照IFCC配置的丙氨酸氨基转移酶基础试剂，然后再配置下述两种不同配方试剂。配方一(后面标示为ALT1)：取适量基础试剂，按照IFCC推荐方法要求，在反应液中加入5’-磷酸吡哆醛溶液。配方二(后面标示为ALT2)：取与配方一相等量的基础试剂，用亚沸水代替5’-磷酸吡哆醛溶液，即在反应液中加入等量的亚沸水。
1.3 检测样品 临床新鲜冰冻血清80例，其中健康人群50例，来自本院健康查体人员;肝病20例、肾病10例(含透析病人3例)均为本院住院患者。
1.4 测定原理 L-丙氨酸+2-酮戊二酸、丙氨酸氨基转移酶、丙酮酸+L-谷氨酸、丙酮酸+NADH+H+、乳酸脱氢酶、乳酸+NAD+。
1.5 方法
1.5.1 常规开机，做好仪器日常维护及实验前质控工作。
1.5.2 主要分析参数设置 测定方法：速率法;反应温度：37℃;光径：10mm;反应时间：10min;孵育时间：5min;延迟时间：1.5min;测定间隔：3min;检测波长：340nm;理论因素：-1905;读数(测定点)：≥6;反应液/样品/起始液：2ml/0.2ml/0.2ml。
1.5.2 操作 根据仪器使用说明及分析参数编制检测程序。
反应液和起始液先在泡沫水箱中孵育，反应液每次孵4～6ml,起始液每次孵育量小于1ml(确保孵育时间小于2h)。临床血清不孵育。
先加样品，再加反应液，毛面靠壁，样品靠壁点低于反应液靠壁点，磁珠搅拌混匀，吸头润洗3次;加入起始液用吸头快速搅拌混匀(毛面来回搅拌8次)。
1.5.3 标本检测 测定前从冰箱中取出新鲜临床血清标本，充分解冻和混匀，严格按IFCC推荐方法文件描述过程进行检测，记录检验结果。
1.5.4 统计分析 线性回归及相关系数计算(以IFCC推荐方法为X轴，不含PLP的结果为Y轴);以IFCC推荐方法检测结果为参比方法，计算另一方法结果的相对百分比偏差。
1.5.5 统计软件 采用Excel2000统计软件。
2 结果
2.1 两种配方试剂对健康人群和患病组的ALT活性测定结果 见表1。表1 ALT活性测定结果
2.2 回归分析
2.2.1 健康人群组 回归方程：Y=0.7829X-1.1101, 相关系数：R2=0.9463。
2.2.2 肝病组 回归方程：Y=0.8232X-2.2316, 相关系数：R2=0.9893。
2.2.3 肾病组 回归方程：Y=0.6096X-21.343,相关系数：R2=0.7786。
3 讨论
试验数据显示，用两种试剂测定健康人群和患者的ALT活性结果存在明显差异，含有PLP的试剂检测结果明显增高。丙氨酸氨基转移酶广泛分布于全身各组织，尤其以肝脏中最丰富，且绝大多数存在于肝细胞的胞浆中，主要催化丙氨酸和2-酮戊二酸之间的氨基转移反应。该酶需要磷酸吡哆醛做辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白，无催化活性。磷酸吡哆醛为转氨酶的辅酶是 Vit B6的一种转化物 ,参与了机体中的多项反应 ,在转氨酶活力测定中起重要作用，血清中ALT以全酶和脱辅基酶形式同时存在，磷酸吡哆醛为其辅酶，在反应中与酶蛋白结合便得到全酶，起到传递氨基作用。在ALT检测试剂中加入磷酸吡哆醛可稳定ALT活性，避免样品中因内源性磷酸吡哆醛不足造成测定结果假性偏低，如心肌梗死、肝病和特别监护病人的结果。同时，ALT检测试剂中加入磷酸吡哆醛还可提高ALT的检测活性。有些疾病，由于人体血清中的磷酸吡哆醛不减低，ALT测定结果与肝肾功能状况或病情一致。而肝脏疾病如急性肝炎、肝硬化晚期，肾脏疾病如慢性肾炎、尿毒症，血透析后，由于肝功能异常，肾功能下降，人为透析造成体内磷酸吡哆醛降低并且程度不一，会导致不含磷酸吡哆醛试剂测出ALT活力，不能真正反映肝肾细胞破坏的程度，出现假性低水平。因此，在临床应用中必须使用含磷酸吡哆醛的试剂，才能保证ALT和AST测定结果的准确可靠。综合观察各试验数据，不论是健康人群，还是不同疾病组患者，其ALT检测数据均与PLP在人体内的含量有关。目前国内的丙氨酸氨基转移酶试剂盒多不加磷酸吡哆醛，但是IFCC推荐加入磷酸吡哆醛，有利于某些疾病的诊断。
作者单位：255100 山东淄博,淄博市淄川区医院检验科