高效液相色谱法测定心达康片的含量

【摘要】  　　目的　应用反相高效液相色谱法测定心达康的含量。方法　以甲醇-0.2％磷酸（45∶55）（pH2.27）为流动相，采用C18化学键合硅胶为固定相，在检测波长368nm下进行测定。结果　槲皮素、山奈素、异鼠李素三种黄酮分别在7.88μg.ml-1～39.39μg·ml-1、1.64μg·ml-1～8.18μg·ml-1、23.40μg·ml-1～117.0μg·ml-1范围内线性良好，日内RSD≤1.38％（n＝3），日间RSD≤1.96％（n＝3），回收率99.4％～100.5％（n＝3）。结论　该方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】  心达康片；总黄酮；高效液相色谱；含量测定

　　Determination of Total Glavanoids in Xindakang Tabalets by HPLC

    LIAO Li-yun1,XU Xiao-ping2,REN Xia3

    (1.Department of Pharmacy,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China;2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China；3.National Chengdu Center for Safety Evaluation of Tradition Chinese Medicine,Chengdu 610041,China)

    Abstract:Objective To determination the content of total flavanoids in Xindakang tabalets by RP-HPLC.Methods The contents of quercetin,kaempferol and isofhamnetin were determined by HPLC simultaneously.C18 column（250×4.6mm,5μm）was used with the mixture of CH3OH-0.2% phosphate (45∶55)（pH2.27）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1 with the detection wavelength at 368 nm.Results The calibration curves showed their good linearities in the range of 7.88 μg·ml-1～39.39μg·ml-1、1.64μg·ml-1～8.18μg·ml-1、23.40μg·ml-1～117.0μg·ml-1 respectively,the within-day RSD and between-day RSD were less than 1.38％（n＝3）and 1.96％（n＝3）respectively;the recovery of total flavanoids was 99.4％～100.5％（n＝3）.Conclusion The method appeared to be simple,reliable and accurate,and it can be used for the quality control of Xindakang tablets.

    Key words:Xindakang tablets；total flavanoids；RP-HPLC；determination

    心达康片主要成分为沙棘总黄酮，具有补益心气、化瘀通脉的功效,对缺血性心脏病、心肌缺血、心血瘀阻型冠心病等疗效显著［1］。原标准采用比色法［2］,只能测定其中总黄酮的含量。吕元琦等［3］采用毛细管电泳法测定出了沙棘药物制品心达康片中山奈酚和槲皮素两种成分，而本实验采用HPLC法同时测定心达康片中槲皮素、山奈素、异鼠李素三个组分,效果好,准确可靠。

    1　仪器和试药

    LC-6A液相色谱仪（岛津）；SPD-10A紫外检测器（岛津）;LC-2002色谱工作站；Branson-200超声清洗仪；GL-88B漩涡混合器（海门麒麟医用仪器厂）；日本A&D电子分析天平。

    心达康对照品：槲皮素、山奈素和异鼠李素（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；心达康片样品（四川雅达药业股份有限公司提供，批号：050501、050502、050503，总黄酮标示量为5mg/片）。

    甲醇（色谱纯）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

    2　方法和结果

    2.1　对照品溶液的制备

    分别取心达康对照品（槲皮素、山奈素、异属李素）适量，用甲醇配成含槲皮素19.69μg·ml-1、山奈素4.90μg·ml-1、异属李素70.14μg·ml-1的溶液，即得。

    2.2　供试品溶液的制备

    取本品10片精密称定，研细。精密称取适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

    2.3　色谱条件

    十八烷基硅烷键合硅胶柱：（150×4.6）mm，5μm；流动相：甲醇-0.2％磷酸（45∶55），pH:2.27；检测波长为368nm；进样量：10μl。理论塔板数按槲皮素、山奈素和异鼠李素峰计算分别大于4 000［4－6］。

    2.4　流动相的选择

    试验了甲醇-水、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸溶液、甲醇-0.02 mol·L-1磷酸溶液等不同流动相体系下心达康片中各组分的分离情况，结果以后者为佳；改变该体系中甲醇的比例，结果当甲醇-0.02 mol·L-1磷酸（45∶55）（pH2.27）时，三组分分离最好，色谱峰达到较高的对称性，获得理想的理论踏板数。由此确定本试验色谱分离流动相为甲醇-0.02 mol·L-1磷酸（45：55）（pH2.27）。

    2.5　检测波长的确定

    按2.1、2.2项下配制对照品溶液和供试品溶液，照分光光度法在200～400nm波长范围内扫描，绘制紫外吸收光谱图，结果在368nm波长处有最大吸收，故确定368nm为本品测定波长。

    2.6　阴性空白试验

    按照心达康片处方量，称取空白辅料适量至50ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤。取滤液作为供试品溶液，按含量测定的色谱条件进行HPLC检查。结果表明，空白辅料不出峰，不会干扰心达康含量的测定色谱图见图1C。

    2.7　色谱分离结果

    在上述色谱条件下，按槲皮素、山奈素和异鼠李素峰计算分别大于4 000条件下，山奈素与异鼠李素峰完全分离，分离度大于1.5。对照品槲皮素、山奈素和异鼠李素的保留时间分别为12.03min,21.13min,24.13min，样品中槲皮素、山奈素和异鼠李素的保留时间分别为12.04min,21.46min,24.53min，见图1A、B。

    2.8　标准曲线的制备

    按本品含量测定项下方法配制系列浓度对照品溶液，分别精密吸取槲皮素、山奈素和异属李素对照品储备溶液各0.4ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度对照品溶液，均以10μl进样，测得峰面积积分值，浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，槲皮素在7.88μg·ml-1～39.39μg·ml-1范围内线性良好，回归方程为：A=26 583C+19 092,r=0.999 2；山奈素在1.64μg·ml-1～8.18μg·ml-1范围内线性良好, 回归方程为：A=40 454C＋5 679.2,r=0.999 0；异鼠李素在23.40μg·ml-1～117.0μg·ml-1范围内线性良好，回归方程为：A=29 542C＋108 332,r=0.999 2。

    用标准曲线低溶液不断稀释进样，测得本品槲皮素、山奈素和异鼠李素最低检出浓度分别为CQ=0.787 7g·ml-1，CK=0.652 8μg·ml-1，CI=0.504 0μg·ml-1即测得本品槲皮素、山奈素和异鼠李素最低检出量分别为7.87ng、6.53ng、5.04ng，最低检测限图见图1D。

    2.9　进样精密度试验

    取本品10片(批号：050501)，研细，分别称取细粉约150mg、200mg和250mg三份，各置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，超声30min，稀释定容至刻度，过滤，取续滤液进样。照上述色谱条件，10μl连续进样测定3次。记录相应峰面积，计算进样精密度结果。槲皮素、山奈素和异鼠李素进样精密度分别0.63％、0.30％和0.56％，满足含量测定要求。

    2.10　重现性试验

    照本品含量测定项下方法配制供试品溶液(批号：050501) 低、中、高浓度共3份，在五个不同日期，照本品含量测定项下方法，测定同一批供试品(批号：050501)含量，槲皮素、山奈素和异鼠李素精密度分别为：低浓度1.05％；1.96％；0.51％，总黄酮4.97mg；。中浓度0.40％；0.00％；0.30％，总黄酮4.96mg。高浓度1.18％；0.00％；0.63％，总黄酮4.95mg。说明样品溶液配制好后五天内测定，结果稳定。

    2.11　重复性试验

    照本品含量测定项下方法配制供试品溶液(批号：050501) 低、中、高浓度各3份，同实验条件下精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪在368nm波长处分离检测，记录各浓度对应色谱峰面积，按外标法计算各标示量，槲皮素、山奈素和异鼠李素精密度分别为：低浓度0.52％；0.00%；0.31%，总黄酮5.00mg。中浓度0.52％；0.00%；0.42%，总黄酮4.97mg。高浓度1.02％；0.00％；1.38％，总黄酮4.98mg。

    2.12　加样回收率试验

    取已知标示量含量（99.50%）的本品(批号：050501)10片，研细，精密称取细粉适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为样品溶液。分别取上述样品溶液5.0 ml 9份于9只10 ml离心管中，分为三组，分别加入低（含Q18.10μg·ml-1、K3.98μg·ml-1、I62.90μg·ml-1）、中（含Q22.60μg·ml-1、K4.91μg·ml-1、I79.60μg·ml-1）、高（含Q26.90μg·ml-1、K5.84μg·ml-1、I94.70μg·ml-1）浓度对照液5ml各三份，混匀，即为回收率考察低、中、高浓度供试品溶液。照本品含量测定的高效液相色谱条件，在368nm波长处分离检测，记录各浓度对应色谱峰面积，计算各组溶液总黄酮的含量，进而计算出回收量，按公式计算回收率。结果见表1。表1　回收率测定结果

    2.13　样品的测定

    2.13.1　对照品溶液的制备　分别取心达康对照品（槲皮素、山奈素、异属李素）适量，用甲醇配成含槲皮素19.69μg·ml-1、山奈素4.90μg·ml-1、异属李素70.14μg·ml-1的溶液，即得。

    2.13.2　供试品溶液的制备　取本品10片，研细，精密称取细粉适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

    2.13.3　测定方法　精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，以外标法计算，即得。结果见表2。 表2　心达康片含量测定结果本次试验了甲醇-水、乙腈－0.02mol·L-1磷酸溶液、甲醇－0.02mol·L-1磷酸溶液等不同流动相体系下心达康片中各组分的分离情况，结果流动相甲醇－0.02mol·L-1磷酸（45∶55）（pH2.27）时能有效分离心达康片剂中三组分，同时具有条件简单、平衡时间短等特点。加0.2％的磷酸使溶液pH为2.27可减少色谱峰的拖尾，使色谱峰达到较高的对称性，获得理想的理论塔板数。由此确定本试验色谱分离流动相为甲醇－0.02mol·L-1磷酸（45∶55）（pH2.27）。

    现有的心达康片的部颁标准是以异鼠李素为对照品，1％三氯化铝的无水乙醇为显色剂，采用分光光度法测定沙棘总黄酮含量。文中采用RP－HPLC法测定心达康片中槲皮素、山奈素、异鼠李素等黄酮含量，不仅可准确测定片中沙棘总黄酮的含量，且可有效地控制各黄酮苷元的含量比例，为完善和提高心达康片的质量控制标准提供依据。

【参考文献】
  ［1］郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用［M］.第三卷.北京：学苑出版社，1998：2423.

［2］部颁标准 WS3-B-2666-97.

［3］吕元琦，邬春华，袁倬斌.毛细管电泳法测定沙棘药物制品心达康片中的山奈酚和槲皮素［J］.化学试剂,2004,26(6)：342-344.

［4］张荣泉，张蓉.高效液相色谱法测定沙棘提取物中总黄酮含量［J］.天津药学,2001,13(3)：65.

［5］翁水旺，赖京华.HPLC法测定心达康胶囊中槲皮素和异鼠李素的含量［J］.中草药,2002，33 (2)：131.

［6］陈雏，张浩.不同厂家的心达康片中黄酮的含量比较［J］.华西药学杂志，2004,19(6)：437-439.