反相高效液相色谱法测定来氟米特

    摘要目的：建立反相高效液相色谱测定来氟米特的方法。方法：采用HypersilODSC18柱，流动相为甲醇-水-磷酸，检测波长为260nm,流速为1.0ml.min-1，进样量为20μl，以萘或联苯酚为内标。

　　结果：两峰分离完全，以萘为内标：来氟米特线性范围0.0955～7.6400μg.ml-1(r=0.9999)，检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n=5)和0.86%(n=5)，平均回收率为99.66%(RSD＝0.80%)；以联苯酚为内标：来氟米特线性范围0.141～8.460μg.ml-1(r=0.9997)，检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.86%(n＝5)和1.06%(n=5)，平均回收率为100.48%(RSD＝1.60%)。

　　结论：方法简便，结果准确。

　　来氟米特(leflunomide,简称LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物，其作用机制不同于已知的抗炎及免疫抑制药物，对多种自身免疫性疾病有治疗作用，Ⅲ期临床试验显示治疗类风湿性关节炎效果显著，1998年由德国HoechsMarionRoussel公司首次在美国上市，但其含量测定的方法未见详细报道。本实验采用的反相高效液相色谱方法，分别以萘或联苯酚为内标，定量分析来氟米特，快速准确，灵敏度高。

　　1、仪器和试药

　　高效液相色谱仪，包括WatersMaxima820工作站，Waters510泵，Waters486可变波长紫外检测器，U6K进样器(美国Waters公司)；UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

　　LFM(本院药物合成室提供)；联苯酚(Sigma公司)；萘(色谱纯，上海试剂一厂)；甲醇(色谱纯，上海化学试剂研究所)。其它试剂均为分析纯。

　　2、实验方法

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱为HypersilODSC18柱(4.6mm×150mm,10μm,大连依利特科学仪器有限公司)，检测波长为260nm，流速为1.0ml.min-1，灵敏度0.01AUFS，进样量20μl，室温操作。以萘为内标，流动相为甲醇-水-磷酸(67∶33∶0.006)；以联苯酚为内标，流动相为甲醇-水-磷酸(65∶35∶0.06)。

　　2.2 储备液、工作液、标准液制备

　　2.2.1 萘作为内标精密称取干燥恒重萘适量，加流动相稀释成1.64mg.ml-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成16.4μg.ml-1的工作液；精密称取干燥恒重LFM适量，加流动相稀释成3.82mg.ml-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成38.2μg.ml-1的工作液。精密量取LFM工作液0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000，2.000ml至10ml量瓶中，加入萘工作液1.000ml，用流动相稀释成0.0955，0.191，0.382，0.955，1.910，3.820，7.640μg.ml-1的系列标准液。

　　2.2.2 联苯酚作为内标精密称取干燥恒重联苯酚适量，加流动相稀释成1.213mg.ml-1的储备液，再精密量取该储备液0.75ml，加流动相稀释成18.195μg.ml-1的工作液；精密称取干燥恒重LFM适量，加流动相稀释成0.564mg.ml-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成56.4μg.ml-1的工作溶液。精密量取LFM工作液0.025，0.050，0.100，0.500，1.000，1.500ml至10ml量瓶中，加入联苯酚工作液0.200ml，用流动相稀释成0.141，0.282，0.564，2.820，5.640，8.460μg.ml-1的系列标准液。

　　3、结果

　　3.1 萘作为内标

　　以LFM的浓度c对LFM与内标的峰面积比R进行回归，在浓度范围0.0955～7.6400μg.ml-1内线性良好，得回归方程c＝-0.0020+0.6989R，r=0.9999(n=7)，方法检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n=5)和0.86%(n=5)，方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。内标萘的保留时间约9.11min，LFM的保留时间约5.92min，两峰分离良好。

　　3.2 联苯酚作为内标

　　以LFM的浓度c对LFM与内标的峰面积比R进行回归，在浓度范围0.141～8.46μg.ml-1内线性良好，得回归方程c＝-0.0458+0.5647R，r=0.9997(n=5)，方法检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.86%(n=5)和1.06%(n=5)，方法回收率为100.48%(RSD=1.60%)。内标联苯酚的保留时间约6.28min，LFM的保留时间约7.53min，两峰分离良好。

　　4、讨论

　　LFM含量测定方法，国内未见报道，国外有报道采用HPLC测定，但都不详细。我们采用萘或联苯酚为内标，适当调整流动相的比例，两峰分离完全，无杂质干扰峰，且灵敏度高，检测限0.8ng，保留时间较理想，可以作为LFM制剂的质控方法。

　　LFM在流动相中的最大吸收波长是260nm，联苯酚在流动相中的最大吸收波长也为260nm，而萘在260nm附近亦有较大的吸收，因此萘和联苯酚都适于作为LFM测定的内标。