高效液相色谱法测定乳梨醇浓度

           摘要　目的：建立高效液相色谱法测定大白鼠小肠液和盲肠液中乳梨醇浓度。
            方法：采用Waters Sugar-Pak1 色谱柱，示差折光检测器，以水为流动相，柱温90℃，流速0.5 mL.min-1。在0.02～2.4 mg.mL-1浓度范围内线性良好，最低检测浓度为20　μg.mL-1，回收率为97.5%（RSD=0.27%，n=5）。

            结果：乳梨醇在小肠内经0h和4h时的浓度分别为(1.14±0.15) mg.mL-1和(0.97±0.15) mg.mL-1，在盲肠内经0h和4h时的浓度分别为(0.95±0.26) mg.mL-1和(0.30±0.08) mg.mL-1。

            结论：肠道给药4h后乳梨醇在小肠内的浓度基本不变，在盲肠内下降了1/3，可能在大肠杆菌中有关酶的作用下降解吸收。

            乳梨醇为4-O-β-D-吡喃半乳糖醇-D-葡萄糖一水化合物，据文献［1］报道大白鼠饲服后在胃和小肠中不吸收，在大肠中降解后吸收。本文采用与文献不同的色谱条件对肠液进行检测，以考察乳梨醇在肠道内的吸收情况。本实验将浓度为20  mg.mL-1的乳梨醇水溶液0.5 mL注入大白鼠两端结扎的小肠和两端结扎的盲肠中，进行活体试验，经0、4 h后将肠腔内的溶液洗出，并定容至10 mL，然后进行测定。为该药的临床研究提供资料。

            1　仪器和试药
            Waters高效液相色谱仪，6000泵，R401示差折光检测器，Beckman高速离心机。乳梨醇原料（由A厂提供）。乳糖醇对照品（美国Sigma公司）。水为重蒸水。

            2　方法学研究
            2.1　色谱条件　色谱柱为Waters Sugar-Pak1，4.0 mm×300 mm，流动相为水，柱温90 ℃，流速0.5 mL.min-1，示差检测器（温度25 ℃，以水为参比液，灵敏度为24×10-6RIU），最低检出浓度：20 μg.mL-1。

            2.2      色谱干扰的排除　在上述色谱条件下，乳糖醇与乳糖、葡萄糖、果糖及麦芽糖均能得到良好分离，不干扰其含量测定。色谱分离见图

            图3　色谱干扰的排除
            1.麦芽糖　2.乳糖　3.葡萄糖　4.果糖　5.乳糖醇
            2.3　线性关系的建立　精密称取乳糖醇对照品适量，加水制成每1 mL中约含50 mg的溶液，精密量取空白肠液1.0 mL，各精密加入上述对照品溶液10、20、30、40、50 μL，混匀，滤过（0.45  μm滤膜），取滤液按上述色谱条件测定，测定结果以乳糖醇峰面积为纵坐标对浓度（mg.mL-1）进行线性回归，求得回归方程为：
            Y=3.338×107X-0.1704×107　r=0.9999

            2.4　回收率试验　精密称取乳糖醇对照品适量，加水制成每1 mL中含1 mg的溶液，作为对照品溶液；另取空白肠液5份，每份1.0 mL，精密加入线性项下的对照品溶液（浓度为50 mg.mL-1）20 μL，同上述色谱条件操作，记录色谱图，按外标法计算，结果：回收率为97.5%，RSD为2.7%（n=5）。

            3.样品测定
            取注入乳梨醇溶液0.5 mL（20 mg.mL-1）经0、4 h的5只大白鼠的小肠液和盲肠液，经高速离心（3000 r.min-1，20 min）后，取上清液滤过（0.45 μm滤膜）,照上述色谱法测定乳梨醇含量结果表明，乳梨醇在小肠内经4 h后浓度与0 h浓度相比无显著差异，乳梨醇在小肠内不降解也不吸收；而在盲肠内经4  h后浓度从(0.95±0.26)mg.mL-1降至(0.3±0.08)mg.mL-1，可能在大肠杆菌中有关酶的作用下降解吸收。与文献报道结果相符.