雌激素对正常人精子运动参数及胞内钙离子的影响

【摘要】  目的 研究雌激素在体外对正常人精子运动参数和胞内钙离子的影响。方法 用不同浓度的雌激素类物质17β雌二醇（E2）作用于人精子，以计算机辅助精子分析系统(CASA)观察人精子体外运动参数的变化；用腺苷酸环化酶抑制剂预处理人精子，通过流式细胞术检测E2、非透膜性大分子物质雌二醇牛血清白蛋白复合物（E2BSA）对精子胞内Ca2+浓度的影响。结果 0.1 μmol/L的E2可显著提高精子前向运动百分率、平均曲线运动速度、平均直线运动速度和平均路径速度(P<0.05)，10 μmol/L的E2明显降低精子的前向运动百分率、平均曲线运动速度和平均路径速度（P<0.05），0.01 μmol/L的E2对精子的各项运动参数无显著影响；E2（0.1 μmol/L）、E2BSA（5 μmol/L）作用后，精子胞内Ca2+浓度均显著升高(P<0.05)；腺苷酸环化酶抑制剂可明显抑制E2或E2BSA引起的精子胞内Ca2+浓度的升高（P<0.05）。结论 雌激素在体外可增强正常人精子的运动力，该效应可能是通过雌激素与人精子膜上雌激素受体结合后，升高精子胞内Ca2+的浓度以及激活腺苷酸环化酶而实现的。

【关键词】  雌激素； 精子运动力； 钙离子； 信号转导途径

Effects of Estrogen on Sperm Movement Parameters and Intracellular Calcium in Fertile Men

    HE Yanfang1, ZHENG Jie2, YUE Limin3.  （1.Department of Pathophysiology, Chengdu Medical College, Chengdu 610083， China；2. Department of Clinical Laboratory, Mianyang Central Hospital, Sichuan Mianyang 621000, China；3. Department of Physiology, West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041，China）

    【Abtract】  Objective  To study the effects of estrogen on sperm movement parameters and intracellular calcium concentrations (［Ca2+］i) in fertile men in vitro. Methods  Sperm movement parameters were determined by computer assisted sperm analysis (CASA) in the presence of different concentrations of E2. Effects of adenylyl cyclase inhibitor and conjugated E2 (E2BSA) on intracellular calcium concentrations (［Ca2+］i) in sperms were respectively measured by flow cytometry. Results  E2 at concentration of 0.1 μmol/L could significantly improve the sperm progressive motility, VSL,VCL and VAP(P<0.05). E2 at concentration of 10 μmol/L evidently reduced the progressive motility, VSL, VCL and VAP (P<0.05). And E2 at concentration of 0.01 μmol/L had no effect on sperm movement parameters. Both E2（0.1 μmol/L）and E2BSA（5 μmol/L）significantly increased the ［Ca2+］i in sperms. The adenylyl cyclase inhibitor could inhibit the increase of ［Ca2+］i induced by E2 or E2BSA (P<0.05). Conclusions  Estrogen can promote the sperm motility in fertile men. The mechanism may be explained by the ［Ca2+］i increase and activation of adenylyl cyclase caused by the integration of estrogen with the membrane receptor on human sperm.

    【Key words】  estrogen； sperm motility； Ca2+； signal transduction pathway

    越来越多的资料表明，雌激素对精子功能起着重要的调节作用。精浆中或雌性生殖道内的雌激素浓度与精子活动力有一定的相关性，并且能够增强精子前向运动力、促进超激活运动的发生、增加精子活力甚至提高精子受精能力［1］，但迄今为止，雌激素影响精子运动能力的相关机制还未阐明。本文拟采用计算机辅助精子检测系统和流式细胞术检测雌激素类物质17β雌二醇（E2）对正常人精子运动力的影响，并探讨其可能的作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂和仪器  17β雌二醇（E2）、雌二醇牛血清白蛋白交联物（E2BSA）、腺苷酸环化酶抑制剂（SQ22536），均购自Sigma公司；Ca2+荧光探针Fluo3/AM，购自Molecular Probe Inc公司；人血清白蛋白(HSA)，购自成都蓉生药业有限公司；计算机辅助精子分析系统(CASA)为杭州麦迪公司产品，流式细胞仪(型号EPICS ELITEESP)为美国Coulter公司产品。

    1.1.2  精液来源与处理  实验所用27例精液标本来自年龄25～40岁，身体健康有正常生育史的成年男性志愿者，其近期精液常规各项指标符合WHO制定的精液检查标准［2］。精液标本置于5％CO2孵箱孵育40min完全液化，用上游法获取活动良好的精子，用BWW低蛋白液调整精子密度至2×107/ml.

    1.2  实验分组和方法

    　　取15例上游精子悬液标本，将每例标本均分为4管，第1管为对照组，第2～4管中分别加入不同浓度E2（终浓度分别为0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、10 μmol/L），置于5％CO2孵箱孵育30 min，随后用BWW低蛋白液离心洗涤2次（500×g，5 min/次），重悬精子至2×107/ml，采用计算机辅助精子分析系统检测精子前向运动百分率、平均曲线运动速度、平均直线运动速度和平均路径速度的变化，每份精子悬液观测8个视野。

    另取12例上游精子悬液标本，每例标本均分为6组，第1管为对照组，第2～6管依次为E2组、E2+SQ22536组、E2BSA组、E2BSA+ SQ22536组、SQ22536组。首先在第3、5管中加入SQ22536（5 mmol/L），并与其余各管在5％CO2孵箱孵育40 min，BWW低蛋白液洗涤、重悬精子。随后在第2、3管中加入E2（0.1 μmol/L），第4、5管中加入E2BSA（5 μmol/L），第6管中加入SQ22536（5 mmol/L），各管均继续孵育15 min，500×g离心2次（5 min/次）。重悬精子后加入Ca2+荧光探针Fluo3/AM（终浓度3 μmol/L），5％CO2孵箱避光负载45 min，500×g离心5 min除去上清液，用无Ca2+、Mg2+的BWW蛋白液洗涤2次去除胞外游离的Fluo3/AM，重悬精子至1×106/ml，采用流式细胞术检测精子内的荧光强度值以反映精子胞内Ca2+浓度的变化。

    1.3  统计学分析 

    实验数据均以x±s表示，用SPSS11.5统计学软件进行单因素方差分析及t检验评价组间差异，P<0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  E2对人精子运动参数的影响 

    不同浓度E2作用后人精子体外运动参数变化见表1。与对照组相比，0.1 μmol/L的E2组精子的前向运动百分率(a+b级精子百分率)显著增加（P<0.05），精子的平均直线速度(VSL)、平均曲线速度(VCL)和平均路径速度(VAP)也明显提高（P<0.05）；10 μmol/L的E2组精子的前向运动百分率、VCL和VAP均明显降低（P<0.05）；0.01 μmol/L的E2组精子的前向运动百分率和各运动参数均未发生明显变化。表1  E2对正常人精子体外运动参数的影响

    2.2  E2、E2BSA、SQ 22536对人精子胞内Ca2+浓度的影响

    结果如图1所示。各组（对照组、E2、E2+SQ22536组、E2BSA组、E2BSA+ SQ22536组、SQ22536组）的荧光强度值分别为6.25±1.55、8.38±1.94、6.44±1.38、8.05±1.73、6.22±1.29、6.03±1.04。E2组、E2BSA组的荧光强度值与对照组相比分别显著升高（P<0.05），并且E2组和E2BSA组间无统计学差异；用SQ22536预处理后，可明显抑制E2或E2BSA引起的精子内荧光强度值的升高（P<0.05），SQ22536组的荧光强度值与对照组无明显差异。

    3  讨论

    　　精子的体外运动参数是反映精子运动能力直观而灵敏的指标，与受精过程的完成密切相关。精子的运动能力受到很多因素的影响，目前发现，卵泡液中或精子自身产生的雌激素可以提高大鼠、仓鼠、小鼠和人精子的前向运动速率、侧向运动速率及鞭打频率等［3］，有学者认为这种作用可能是通过快速的膜信号途径实现的，但是此过程所涉及的相关信号分子还不清楚。

    本实验中，0.1μmol/L E2能够显著提高人精子的各项体外运动参数，该结果与以往的报道是一致的［4］，进一步为雌激素对人精子运动功能的促进作用提供了证据。同时作者也发现，雌激素对精子的运动能力的影响存在一定的剂量依赖性。高剂量的E2（10μmol/L）导致精子前向运动百分率和体外各运动参数明显降低，低剂量的E2（0.01μmol/L）则不影响精子的前向运动百分率和体外各运动参数。Rozati等人认为，精子所处环境中的雌激素水平过高时，精子的发生、成熟以及各种功能的获得都会受损，从而导致生育能力降低［5］。有资料表明，雌激素受体（ER）基因敲除动物或芳香化酶缺乏男性，其精子数量、存活率、运动力、受精能力等均低于正常［6］。因此，高剂量的E2可能会通过一定的途径抑制精子的运动力，而过低剂量的雌激素可能不足以激活精子。

    雌激素可以通过与细胞膜上的雌激素受体相互作用，从而产生快速的生物学效应，雌激素受体被激活后，可能改变细胞内Ca2+的浓度。另外，精子获得运动能力主要依靠尾部鞭毛，而控制鞭毛运动的因子主要是Ca2+。因此，作者进一步用流式细胞术检测了E2以及大分子复合物E2BSA对人精子胞内Ca2+的影响。结果显示，E2BSA可引起精子胞内Ca2+浓度明显升高，并且其作用与游离的E2无显著差异。众所周知，E2BSA是一种不能透过细胞膜发挥作用的大分子物质，其中不含游离的雌二醇，因此，雌激素对人精子功能的影响可能借助膜信号途径来实现。已有资料证实，人精子膜上存在雌激素受体（ER），其分子量大约29 KD［7］。作者推测，雌激素对人精子运动能力的调节可能是通过精子膜上的雌激素受体介导，从而引起精子内Ca2+浓度的升高。但是有关人精子膜雌激素受体的结构和及其与精子功能状态的关系还不清楚。

    　　腺苷酸环化酶（AC）及环腺苷酸（cAMP）依赖性蛋白激酶对精子运动也起着重要作用。在多种哺乳动物精子实验中，AC激动剂或cAMP类似物都能刺激并提高精子的活力［8］。多数学者认为，胞外钙离子内流后引起胞内Ca2+浓度的迅速升高是精子运动功能调节的重要途径［9］。本实验发现，AC抑制剂可明显抑制E2、E2BSA所引起的精子内Ca2+浓度的升高。这提示，精子内Ca2+浓度的升高与ACcAMP信号转导通路间存在着相互的激活，精子内Ca2+浓度的升高也可由胞内蛋白激酶系统启动。雌激素促进人精子运动力的这一过程中可能涉及到ACcAMP信号转导途径的激活以及内源性或外源性Ca2+的释放。cAMP引起蛋白质磷酸化，特别是鞭毛纤维鞘中的谷胱甘肽S转移酶(FCS1)磷酸化对维持精子活力十分重要。腺苷酸环化酶可使胞内cAMP生产增多，继而激活蛋白激酶A(PKA)，PKA能磷酸化位于顶体外膜的电压依赖性钙通道，后者使顶体内部的Ca2+释放至胞质中，引起［Ca2+］i 的升高［10］。

    　　综上所述，一定剂量的雌激素在体外可提高正常人精子的运动能力，该作用可能是通过雌激素与精子膜上的雌激素受体结合后，升高精子内钙离子浓度以及激活腺苷酸环化酶信号转导途径而实现的。但是，雌激素是否还通过其它信号途径对人精子运动功能进行调节，胞内钙离子浓度升高的途径还有哪些，以及雌激素对不育男性精子运动力的影响等问题还有待进一步研究。

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