两种凝血酶原提取方法的比较

【摘要】  目的 比较等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度。方法 分别采用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原，凝血酶原经单独钙离子激活得到凝血酶，通过凝血酶效价测定、蛋白质浓度测定，计算出凝血酶的比活性。结果 采用等电点沉淀法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为11.01±1.54 U/mg，采用柠檬酸钡吸附法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为130.17±12.30 U/mg，经配对T检验，P＜0.01.结论 与等电点沉淀法相比，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取得到的凝血酶原纯度更高。

【关键词】  凝血酶原； 凝血酶； 等电点沉淀法； 柠檬酸钡吸附法

Comparative Analysis of Two Extraction Methods of Prothrombin

    LAI Yi,WU Minlu,DAI Juan,CHEN Man,DUAN Jiahui,LIU Yang*

    (Department of Lab Medicine,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China)

    【Abstract】  Objective To compare the purity of prothrombin purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from blood plasma of pig.Methods Prothrombin was purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from blood plasma of pig and activated by Ca2+ only to thrombin.Then the titer of thrombin and the concentration of protein were measured to get the specific activity of thrombin.Results The specific activity of thrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified by method of precipitating at isoelectricpoint was 11.01±1.54 U/mg.The specific activity of thrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified by adsorption method with barium citrate was 130.17±12.30 U/mg.The specific activities were analyzed by paired Ttest,P＜0.01.Conclusion The purity of prothrombin purified by adsorption method with barium citrate is higher than purified by method of precipitating at isoelectricpoint.

    【Key words】  prothrombin；  thrombin；  method of precipitating at isoelectricpoint；  adsorption method with barium citrate

    凝血酶是参与机体凝血过程的一个重要的凝血因子，在体内以凝血酶原形式存在［1］。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆，国内采用猪血浆制备凝血酶的报道较多［2］。等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原经单独的钙离子激活可得到凝血酶。目前，国内尚无研究比较应用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法所得到的凝血酶原纯度的差异，哪种方法得到的凝血酶原纯度更高？更适合用于提取凝血酶原?本文对这两种方法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度进行了比较。为相关实验中选择合适的凝血酶原提取方法提供参考。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    柠檬酸钠抗凝的新鲜猪血浆。

    1.2  主要试剂

    纤维蛋白原和凝血酶标准品购自美国SIGMA公司，Bradford蛋白质定量检测试剂盒购自美国BioRad。其余试剂均为国产分析纯。

    柠檬酸钡吸附法使用的四种溶液分别为，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.

    1.3  主要仪器

    GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析仪。

    1.4  方法

    1.4.1  凝血酶原提取  将收集到的5份猪血浆按1～5编号，各均分为2份，其中1份采用等电点沉淀法提取凝血酶原，另1份采用柠檬酸钡吸附法提取凝血酶原。

    1.4.1.1  等电点沉淀法  猪血浆用蒸馏水稀释10倍，用5 %冰乙酸将其pH调至5.3，4℃静置过夜，3 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，过滤备用。

    1.4.1.2  柠檬酸钡吸附法  猪血浆中加入溶液A，体积比为10∶1，4℃搅拌30 min，静置30 min后，3 000 r/min离心30 min，弃上清。沉淀用溶液B洗涤，3 000 r/min离心15 min，弃上清。重复洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃搅拌0.5～1h，3 000 r/min离心15 min取上清。上清液用溶液D于4℃透析过夜。3 000 r/min离心15 min取上清液，即为凝血酶原溶液。

    1.4.2  凝血酶原激活  用2 % Na2CO3溶液将凝血酶原溶液的pH调至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2+终浓度为0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液将凝血酶原溶液的pH调至7.1，室温静置2 h，过滤即得凝血酶溶液。

    1.4.3  凝血酶比活性测定  根据文献［4］提供的方法配制0.1 %纤维蛋白原溶液。

    凝血酶效价测定［4,5］：取凝血酶标准品，用生理盐水配制成效价(U/mL)分别为5、6、7、8、9、10的标准品溶液。另取1×10 cm的塑料试管6支，各加入0.1 %纤维蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴预热5 min，再分别取已37℃预热的上述6个浓度的标准品溶液各50 μl，迅速加入上述各试管中，立即计时并摇匀，记录凝固时间。每个浓度测2次，求平均值，做标准曲线。待测样品用生理盐水稀释适当浓度，取50 μl，按标准曲线的测定方法平行测定2次，求平均值，根据标准曲线或回归方程计算样品的效价。

    根据文献［6］，采用Bradford法测定样品的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准品，每个样本平行测2次，取平均值。根据公式：酶比活性=酶效价/溶液蛋白质浓度，计算凝血酶溶液的比活性。

    2  结果与分析

    以凝血酶标准品溶液效价 (U/mL)为X，对应的凝固时间（sec）为Y进行直线回归处理，并求得直线回归方程，所得方程式为：Y=62.9135.994X，r≈0.994 8.将凝血酶样品的凝固时间代入回归方程，即可计算得出样品的凝血酶效价(见表1、图1)。

    采用等电点沉淀法得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性为11.01±1.54 U/mg，而采用柠檬酸钡吸附法提取得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性可达到130.17±12.30 U/mg。其比活性经配对样本t检验统计学分析后，其概率P=3.54×105＜0.01，说明两种方法得到的凝血酶比活性有显著性差异，后者约为前者的11.8倍。从两种方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白质浓度分析，造成两者酶比活性差异的主要原因在于凝血酶的纯度差异，凝血酶纯度越高，比活性就越高。等电点沉淀法提取的凝血酶原溶液含杂蛋白较多，需要进一步纯化，以提高酶的比活性。因而，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原大大优于等电点沉淀法，得到的凝血酶纯度较高。

    3  讨论

    从血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副作用的优点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾病和血栓性疾病的临床检测［7］。由于人血浆资源的限制性，目前国内采用猪血浆提取凝血酶的报道较多，等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原经单独的钙离子激活即可得到凝血酶。表1  两种提取方法所得到的凝血酶比活性

    等电点沉淀法根据蛋白质在溶液pH为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用1 %的醋酸将适当稀释后的血浆pH调至凝血酶原的等电点5.0～5.5之间，即可使凝血酶原析出。该方法虽然操作简便，成本较低，但得到的凝血酶含杂蛋白较多，比活性低，达不到临床药物和检测试剂的纯度要求，还需要进一步的纯化，而纯化步骤越多，酶的回收率则相应降低，不能有效的利用资源。

    柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素K的凝血因子这一特性，在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用EDTA解吸附，离心去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液。虽然该方法看似操作较为复杂，但得到的凝血酶纯度较高，可直接用于检测试剂的制备，也可根据目的选择进行中度纯化，相比等电点沉淀法其回收率更高，实际上节约了成本。

    另外，无论是等电点沉淀法还是柠檬酸钡吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的复溶过程是影响凝血酶得率的一个关键步骤。在柠檬酸钡吸附法中，用EDTA解吸附凝血酶原应在冰浴中搅拌0.5 h以上，直至溶液呈现胶冻状态为止，使凝血酶原充分溶解于缓冲液中。

【参考文献】
  ［1］ 张智明.凝血酶的研究进展［J］.海峡药学,2006,18(6): 13.

［2］ 施大林,陆茂林,吕惠敏,等.猪血凝血酶的制备［J］.生物技术,2002,12(1): 18.

［3］ 宋宏新,马永征,李敏康.凝血酶分离纯化方法的研究进展［J］.食品研究与开发,2004,25(6): 6567.

［4］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药典三部［M］.北京: 化学工业出版社,1995,1 1281 129.

［5］ 郝苏丽,沈佳,徐康森.凝血酶效价测定法的改进［J］.药物分析杂志,1995,15(1): 5961.

［6］ 汪家政,范明.蛋白质技术手册［M］.北京: 科学出版社,2000,4247.

［7］ 何英武,吴瑞玲.血浆纤维蛋白原测定的方法进展及临床意义［J］.现代中西医结合杂志,2004,13(18): 2 5112 512.