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【关键词】 人类新基因;金属硫蛋白2A;酵母双杂交
大量的研究结果表明血管内皮细胞损伤既是诱发机体发生凝血障碍、休克和多脏器损伤等严重病症的重要因素，又是这些疾病的基本病理改变之一。内皮细胞过度活化引起的失控性炎症反应是血管内皮细胞损伤的病理基础。目前已经知道缺血、缺氧及内毒素等刺激都可以使内皮细胞处于应激状态，但对于内皮细胞的活化及其调控机制还不清楚。内皮活化相关新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelialoverexpressed LPS associated factor 1，EOLA1)系2002年发现的人类新基因，初步的研究结果表明该基因的表达和LPS刺激血管内皮细胞有关，可能参与了血管内皮细胞的活化进而引起内皮细胞损伤的过程。阐明疾病相关新基因的功能是后基因组时代的一个重要研究方向。蛋白质相互作用研究是研究基因功能的一个有效途径。我们前期应用酵母双杂交技术发现EOLA1和金属硫蛋白2A(metallothionein 2A，MT2A)存在相互作用，并应用免疫共沉淀技术对其相互作用关系进行了验证。金属硫蛋白是体内比较保守的蛋白质家族，这些蛋白的诱导和表达与机体抗DNA损伤、氧化应激保护及细胞凋亡调控有关。目前的研究表明MT2A还与细胞的增殖分化存在紧密的联系，在多种癌组织中发现MT2A过度表达，MT2A有可能成为新的肿瘤标志物。机体内的各种生物学过程最终要靠蛋白质之间的相互作用来完成，存在直接相互作用的蛋白质在功能上往往密切相关，深入研究EOLA1和MT2A的相互作用关系可以进一步了解人类新基因EOLA1的功能及其在内皮细胞活化过程中的功能角色，有助于深入了解内皮细胞的活化机制。本课题主要应用酵母双杂交和RNAi干扰两项分子生物学技术对EOLA1和MT2A的相互作用关系进行研究，涉及的主要研究内容包括以下几个方面：1.EOLA1与MT2A相互作用位点及其在细胞内的共定位情况：应用酵母双杂交系统确定EOLA1与MT2A相互作用位点，通过位点基因序列推导出其对应的氨基酸序列，了解其相互作用位点模式，从而为了解EOLA1功能提供信息。利用绿色荧光蛋白载体(EGFP)构建EGFPEOLA1共表达载体，转染人脐带血管内皮细胞，双抗染色后在激光共聚焦下观察其在细胞内的定位。2.EOLA1与MT2A的上下游关系：应用强制表达技术和RNA干扰(RNAi)技术建立人脐带血管内皮细胞EOLA1强制表达和下调表达模型，分别检测两模型MT2A的表达情况，根据两细胞模型MT2A的表达情况确定EOLA1是否参与调解MT2A的表达。采用同样手段了解MT2A是否参与调解EOLA1的表达。通过上述研究来了解EOLA1和MT2A的上下游关系。3.EOLA1是否参与了内皮细胞的应激反应过程：用LPS刺激人脐带血管内皮细胞EOLA1强制表达和下调表达模型及未经转染的内皮细胞，应用ELISA技术检测三类细胞相关炎症因子的表达强度，从而推测EOLA1是否参与了LPS激活内皮细。