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【摘要】 目的 观察人脐带血干细胞(HUCBSC)移植对大鼠急性心肌梗死后左室重构的影响。方法 采用FicollHypague法分离培养HUCBSC;健康雄性Wistar大鼠40只,随机均分为对照组和实验组,分别将脐带血和HUCBSC经心外膜下植入对照组和实验组梗死心肌周围。结果 移植术后4周,实验组左心室非梗死区心肌骨桥蛋白基因(OPN mRNA)、Ⅰ型胶原和AngⅡ含量均显著低于对照组(P<0.05)。Pearson直线相关分析表明,实验组和对照组心肌AngⅡ、Ⅰ型胶原与OPN mRNA三者之间两两均呈正相关(P<0.05)。结论 人脐带血干细胞移植可能通过抑制大鼠心肌Ⅰ型胶原合成,下调心肌AngⅡ和OPN基因表达,减轻左室重构。
【关键词】 人脐带血干细胞;细胞移植;急性心肌梗死;心室重构
【Abstract】 Objective To observe the influence of human umbilical cord blood stem cell (HUCBSC) transplantation on the left ventricular remodeling of rats after acute myocardial infarction (AMI). Methods HUCBSC was separated and cultured by FicollHypague method. Forty male Wistar rats were randomly divided into control group and transplantation group. The cord blood and HUCBSC suspension were implanted via epicardium into the surrounding area of infracted cardiac muscle of control group and transplantation group,respectively. Results Four weeks after the implantation,in the transplantation group,the myocardial osteopontin (OPN) mRNA,type Ⅰ collagen and angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) content of noninfarcted zone in left ventricle were all significantly lower than those of control group (P<0.05). Pearson linear regression analysis indicated that the myocardial OPN mRNA,type Ⅰ collagen and Ang Ⅱ content presented positive correlation with each other (P<0.05). Conclusion It is concluded that allogenic HUCBSC transplantation may ease left ventricular remodeling after AMI by inhibiting the synthesis of type Ⅰ collagen in the cardiac muscle and downregulating the expression of Ang Ⅱ and OPN gene.
【Key words】 human umbilical cord blood stem cells; cell transplantation; acute myocardial infarction; ventricular remodeling
急性心肌梗死后心室重构,可引起充血性心力衰竭。近年来,人们对干细胞移植做了一些研究,认为干细胞移植可防治心室重构及某些心血管疾病[13]。本实验观察人脐带血干细胞(HUCBSC)移植对大鼠急性心肌梗死后心室重构的影响,为探讨干细胞移植改善急性心肌梗死后心室重构提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
DMEM高糖培养基购自美国 Gibco公司;胎牛血清、Ficoll分离液购自美国 Sigma公司;Ellsia试剂盒购自美国基因公司;青霉素、链霉素、PBS购自上海碧云天生物技术有限公司;选用Wister雄性大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)40只,体重200～250 g.
1.2 脐带血采集和 HUCBSC分离培养
选择2009年3月于我院妇产科分娩的无妊娠并发症的足月分娩产妇1例,在无菌条件下,待胎儿娩出而胎盘仍在宫腔内时,在距胎儿5～7 cm处结扎并剪断脐带,用加有20 U/ml肝素的注射器穿刺脐静脉抽取脐带血50 ml.采用FicollHypague法[4]分离 HUCBSC,将脐带血用 PBS以1∶1稀释后轻轻加入盛有Ficoll分离液的离心管中,2500 r/min离心25 min,吸管吸取分层界面的白色环形絮状物(富含单个核细胞);PBS洗涤2次(1200 r/min,离心8 min)除去 Ficoll分离液,沉积细胞用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基培养,调整细胞密度为 1×108 个/ml,接种于25 cm2 的培养瓶内,放置在37℃、5% CO2 、饱和湿度的培养箱中培养。细胞接种12 h后即可见极少量的梭形细胞贴壁,孵育24 h后更换培养基,24 h后贴壁细胞开始增多,似成纤维细胞,夹杂少许红细胞及细胞碎片,去除红细胞及其他未贴壁细胞,以后视细胞生长情况平均3 d换液1次,随着细胞换液,未贴壁细胞逐渐清除,贴壁细胞的同质性增强,约3周后细胞融合达瓶底生长面积的70%～80%,即可进行细胞移植。
1.3 动物模型的制作及分组
动物取仰卧位,腹腔内注射戊巴比妥液(40 mg/kg)麻醉下行气管插管,应用小动物用呼吸机辅助呼吸。经左侧第4肋间开胸,扩开肋间,剪开心包,暴露心脏。于左心耳下,用60外科针带线结扎左冠状动脉前降支起始部,以远端供血区心肌颜色发绀、苍白为模型制作成功的标志。40只大鼠随机分为两组:对照组(20只)和实验组(20只),分别在对照组和实验组大鼠梗死心肌周围均分6点心外膜下植入脐带血(50 μl/点)及HUCBSC(50 μl/点)，关胸,继续饲养。围术期应用青霉素200 000 U/kg预防感染,连用3 d，4周后静脉注入KCl,使心脏停搏。
1.4 Ⅰ型胶厚、血管紧张素Ⅱ及心肌骨桥蛋白测定
用全自动图像分析系统(北京航空航天大学)及400倍显微镜(日本Olympus公司)计算心室肌非梗死区Ⅰ型胶原容积分数(CVF)。用放射免疫分析方法测定非梗死区心肌中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量。用RTPCR技术检测左室非梗死心肌骨桥蛋白(OPN)mRNA表达(OPN/GAPDH)。
1.5 统计学处理
所有计量数据采用均数±标准差(±s)表示,各组均数间比较前先进行正态分布及方差齐性检验,各组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差检验。所有数据统计均由SPSS13.0软件包处理,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
术后4周,对照组和实验组各存活16只。实验组左心室非梗死区心肌AngⅡ浓度、OPN mRNA和Ⅰ型胶原含量均显著低于对照组(P<0.05,表1)。Pearson直线相关分析表明,对照组和实验组左心室非梗死区心肌AngⅡ含量、OPN mRNA的变化与Ⅰ型胶原产量之间两两均呈正相关(图1～6)。表1 非梗死区心肌Ⅰ型胶原、OPN/GAPDH比值与AngⅡ变化
3 讨论
急性心肌梗死后心室重构可引起心力衰竭、室壁瘤和心律失常发生,死亡率高。心肌梗死后,心肌间质胶原的增加以及心肌的肥大可导致心室收缩和舒张功能下降[5]，有效地抑制胶原合成,可改善心室重构,提高心功能。本研究显示,实验组非梗死区Ⅰ型胶原含量明显低于对照组,提示同种HUCBSC移植能减少非梗死区心肌间质胶原沉积,逆转非梗死区心肌胶原网络重塑,有利于增加心室顺应性,提高心功能。
AngⅡ在心肌梗死后心室重构中起重要的作用。心肌局部AngⅡ增加,可导致胶原合成增加,加速心肌纤维化的进程[6]。本文采用放射免疫方法研究发现,实验组4周后血浆及心肌AngⅡ水平均有不同程度的下降,说明梗死后早期应用HUCBSC移植治疗,可通过抑制AngⅡ水平而在一定程度上抑制心肌梗死后心室重构的进展。
OPN作为一种机体反应蛋白,在抗炎、损伤修复及血管重塑过程中的重要作用,逐渐引起人们的重视[7,8]。在心室重构中除AngⅡ直接促进心肌纤维化,还可能间接通过增加OPN,促进Ⅰ型胶原等细胞外基质对成纤维细胞活性的调节,使成纤维细胞过度增殖,胶原异常沉积而进一步加重AMI后心室重构[9]。本研究结果显示,大鼠急性心肌梗死后4周,非梗死区心肌组织中OPN mRNA表达增高的同时,伴有心肌AngⅡ表达增高,提示AMI后OPN可能在心肌梗死后心室重构中起着重要作用。在本研究中,大鼠AMI后应用同种异体骨髓单个核细胞移植可以降低非梗死区心肌AngⅡ浓度,同时也降低了非梗死区心肌OPN mRNA的表达,这说明HUCBSC移植至少可能通过减少AngⅡ合成而降低OPN基因的表达,从而抑制AMI后心室重塑。
总之,HUCBSC移植可抑制AngⅡ和OPN的表达,减少胶原的合成,改善心功能。这一研究结果有望为防治和逆转心肌梗死后心室重构提供新的实验依据。 图1 对照组 非梗死区心肌中AngⅡ含量与Ⅰ型胶原产量呈正相关(r=0.718,P<0.05)图2 实验组 非梗死区心肌中AngⅡ含量与Ⅰ型胶原产量呈正相关(r=0.922,P<0.05)图3 对照组 非梗死区心肌中OPN mRNA表达与Ⅰ型胶原产量呈正相关(r=0.898,P<0.05)图4 实验组 非梗死区心肌中OPN mRNA表达与Ⅰ型胶原产量呈正相关(r=0.872,P<0.05)图5 对照组 非梗死区心肌中AngⅡ含量与OPN mRNA表达呈正相关(r=0.805,P<0.05)图6 实验组 非梗死区心肌中AngⅡ含量与OPN mRNA表达呈正相关(r=0.892,P<0.05)
【参考文献】
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