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【摘要】 目的 观察重组人表皮生长因子(rhEGF)联合纳米银护创液作用于糖尿病溃疡动物模型创面的疗效。方法 建立糖尿病溃疡动物模型,随机分为重组人表皮生长因子组和重组人表皮生长因子+纳米银护创液组,动态观察两组的溃疡愈合面积、愈合时间及动态愈合率。结果 重组人表皮生长因子+纳米银护创液组溃疡的面积变化、愈合时间及动态愈合率与重组人表皮生长因子组相比较均有显著性差异(P<0.01)。结论 重组人表皮生长因子与纳米银护创液联合使用比单纯使用重组人表皮生长因子更能显著促进糖尿病溃疡创面的愈合。
【关键词】 糖尿病溃疡;模型;重组人表皮生长因子;纳米银护创液
Abstract:Objective To observe the efficacy of recombinant human epidermal growth factor combined with nanometer silver solution to animal model of diabetes ulcers.Methods The animal model of diabetes ulcers was established.The animals were randomly divided into rhEGF group and rhEGF combined with nanometer silver solution group.The healing area of the ulcer,healing time and healing rate of the ulcer were compared between the two groups.Results In rhEGF combined with nanometer silver solution group,there was significant difference in the healing area of the ulcer,healing time and healing rate of the ulcer compared with those observed in rhEGF group.Conclusion rhEGF combined with nanometer silver solution can promote healing of diabetes ulcers compared with using rhEGF independently.
Key words:diabetes ulcers;model;rhEGF;nanometer silver solution
近年来,随着人民生活水平的日益提高、老龄化社会的到来,糖尿病的发病率正在逐年上升。研究推测,到2015年全世界将有2.43亿糖尿病患者,2025年将达到3亿[1],而每位糖尿病患者在其生命周期中发生溃疡的比例为15%.糖尿病溃疡一旦发生,治疗非常困难,容易形成慢性溃疡且复发率高,造成患者生活质量的严重下降和沉重的经济负担,故促进糖尿病溃疡的愈合对于改善糖尿病的预后具有重要意义。本实验通过在糖尿病溃疡动物模型上联合使用重组人表皮生长因子和纳米银护创液,观察两者联合使用对糖尿病溃疡的疗效,为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康成年Wistar大鼠30只,雄性,体重250300g左右,纯系,由大连医科大学实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK(辽)310101045)。
1.1.2 实验仪器和药品
MA240电子天平(上海第二天平仪器厂制造);罗氏ACCUCHEK ACTIVE血糖仪购自瑞士Roche公司;圆片形磁铁(直径12 mm,厚2 mm)购自西安钢铁研究所(磁片表面的磁通量为1500高斯。所有磁片在移植前均高压灭菌。磁通量的选择是根据诱导溃疡的流体静力压推导出来的,研究表明,当外加压力超过局部毛细血管的压力时,就可诱导溃疡,而外加压力为50 mmHg左右最合适);重组人表皮生长因子凝胶(10万IU/支,桂林华诺威基因药业有限公司,国药准字S20020113);纳米银护创液(nanometer silver solution,江苏常熟市汇涵医用材料厂,批号100702);Stmptozotocin(STZ)购自德国Calbiochem公司,使用前用pH 4.6、0.1mmol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素(STZ),配成1%溶液。
1.2 方法
1.2.1 糖尿病大鼠皮肤溃疡模型的建立
健康成年Wistar大鼠30只,雄性,体重250300g左右,由专人分笼喂养,房间温度保持在25℃左右,湿度保持在50%左右,明暗周期12 h,自由饮水和进食,适应性饲养1周后以pH4.6、0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素(STZ),配成1%溶液,以60 mg/kg连续3d腹腔内注射诱导糖尿病,注射3d后尾静脉采血和收集尿液,用血糖仪和试纸法分别检测随机血糖水平和尿糖水平。注射后随机血糖水平>16.7 mmol/L,视为糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠实验期间自由进食、饮水,每周监测体重和血糖,根据血糖水平皮下注射低精蛋白胰岛素(NPH)12 U/d,血糖维持在16.728 mmol/L.糖尿病大鼠成模6周后,用3%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg腹腔注射麻醉,背部剪毛,75%酒精消毒,以边长为1.2 cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后lcm处形成一个1.2 cm×1.2 cm的正方形伤口,切除范围深达筋膜,钝性分离,将磁片植入大鼠左前肢或右前肢的皮下,第二切口位于大鼠背部后端正中线,磁片植入后肢的前端磁片的对侧位置,缝合切口,然后在植入磁片对应的皮肤外接添加外源磁片,使外源磁片与体内移植磁片相互产生吸引,从而对皮肤产生压力,造成局部皮肤缺血,每次缺血2h后,再将外源磁片拿下,让局部血流恢复30min,如此进行一个循环。每只大鼠每日进行3个连续的循环,连续进行4d.以皮肤变黑、变硬、针刺不出血作为判断溃疡形成的标准。期间每只大鼠单笼饲养,自由饮水与进食。
1.2.2 实验动物分组
将动物模型随机分为两组:重组人表皮生长因子组和重组人表皮生长因子+纳米银护创液组,每组均为15只,分别予以单纯性重组人表皮生长因子凝胶外敷及重组人表皮生长因子凝胶外敷+纳米银护创液局部喷洒联合治疗。
1.2.3 治疗方法
2组大鼠单笼喂养,换药时均先用1%碘伏清创,再以无菌生理盐水冲洗创面并拭干。重组人表皮生长因子组单用重组人表皮生长因子凝胶均匀涂抹创面(每100 cm2创面使用凝胶10 g),重组人表皮生长因子+纳米银护创液组先局部喷洒纳米银护创液(每100 cm2创面喷洒0.5 ml),待其干后再外敷重组人表皮生长因子凝胶,二组均采用无菌纱布包扎固定。每天换药1次,观察溃疡面愈合情况。
1.2.4 溃疡愈合时间的观察
溃疡愈合标准以未愈合面积小于原溃疡面积的5%或溃疡愈合面积大于95%为完全愈合。
1.2.5 溃疡愈合面积及愈合速率的观察
各组动物分别于伤后第3、7、10、14天,用透明塑料片覆盖溃疡面,用笔划出溃疡边缘,沿边缘剪下塑料片,置于分度值为0.1 mg的电子天平上称重,并按1 cm2塑料片的重量,将其重量换算成面积。用德国产ASM68K自动图像分析仪计算溃疡愈合速率(溃疡愈合速率=溃疡愈合面积/原溃疡面积)。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示,以SPSS 11.5统计软件进行组间的单因素方差分析。
2 结果
2.1 一般情况
所有动物均于麻醉后12h苏醒,开始活动,自由进食饮水。试验期间动物活动好,食欲可,体重较稳定。
2.2 研究发现
重组人表皮生长因子+纳米银护创液组在糖尿病溃疡面积变化、愈合时间及愈合率方面的疗效均优于重组人表皮生长因子组(P<0.01)(表13)。表1 糖尿病溃疡面积(cm2)的动态变化比较表2 糖尿病溃疡创面愈合时间比较表3 糖尿病溃疡创面动态愈合率比较
3 讨论
糖尿病患者因长期高血糖致微血管病变引起动脉粥样硬化、血栓形成,导致血管狭窄、阻塞、血流受阻,或因毛细血管基底膜增厚,内皮细胞增生,红细胞变形率下降,血液浓缩,血小板凝聚力增强,使微循环发生障碍,导致皮肤供血不足,而病变组织通常不能对创伤和感染及时做出反应,致使机体受到微小创伤时易合并感染而引发糖尿病溃疡的发生[2,3]。糖尿病溃疡的修复需要有充足的血液供应和良好的创面愈合环境。近年来,随着对创面愈合过程中生长因子变化的深入研究,发现创面局部生长因子缺乏和活性下降如生长因子糖基化等因素是造成创面愈合的重要原因[4],这就给补充外源性生长因子促进糖尿病溃疡愈合提供了理论依据。
皮肤溃疡愈合是一个复杂的生物学过程,是炎症细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并以高度协调、相互调控方式进行的复杂机制[5],通常是由成纤维细胞增殖分化、新生血管的形成、细胞外基质纤维化和表皮细胞增生覆盖溃疡面等综合作用的结果。糖尿病皮肤溃疡由于糖代谢紊乱、神经病变、供血不足,局部组织降解过度,衰老细胞增多,对细胞信号的反应性下降及其代谢产物所致的组织修复细胞、细胞外基质、生长因子等生物学行为的改变,导致其对一般治疗反应呈低应答性[6]。在外源性因素(如外伤、感染等)的侵袭下,创面常常难以愈合而形成慢性难治性溃疡[7]。研究表明,生长因子水平下降是糖尿病创面愈合延迟的重要原因。生长因子可通过增强细胞移动、迁移,促进新生血管形成,合成细胞外基质产物,促进成纤维细胞增殖,加速上皮形成,调节蛋白酶类产物以及参与创面重塑等促进伤口愈合。局部应用外源性生长因子可加速糖尿病溃疡愈合。
生长因子是一类能调节细胞生长和分化、促进组织愈合的多肽或蛋白质,由非腺体细胞以旁分泌或自分泌的方式产生,在体内浓度极低,但有着广泛和高度的生物学活性。生长因子生物活性是通过与表皮生长因子特异性受体(EGFR)结合而实现的。生长因子通过与细胞膜上的特异性受体相结合,引起膜受体胞内段酪氨酸蛋白激酶磷酸化,导致蛋白G和磷酸脂酶C激活等一系列生化反应而发挥生物学作用。造成细胞内游离Ca2+增多,促进糖酵解及DNA和RNA、蛋白质的合成,从而促使与组织修复相关的成纤维细胞和内皮细胞等的分裂、增殖以及细胞外基质的合成与分泌,加速溃疡面愈合。
重组人表皮生长因子(rhEGF)是一种由53个氨基酸组成的单链多肽,它是利用基因重组技术,通过人EGF基因片段在表达系统充分表达而制备的外源性表皮生长因子,其结构和生物学活性与人体内源性表皮生长因子高度一致。研究表明,重组人表皮生长因子对外胚层和内胚层来源的细胞具有很强的促分裂作用,是表皮细胞的化学性趋化因子和特异性促有丝分裂原,它能促进表皮细胞的分化、增殖、分泌和移行,对多种靶细胞有着增强作用,可促进动物溃疡创面组织修复过程中的DNA、RNA和羟脯氨酸的合成,加速溃疡面肉芽组织的生成和表皮细胞的增殖,从而缩短溃疡面的愈合时间。rhEGF的持续存在能显著增加成纤维细胞数量、新生血管形成、胶原积聚和上皮再生,从而加速溃疡面的愈合[8],且外源性生长因子可促进内源性生长因子的表达,从而刺激组织分泌生长因子。生长因子通过与细胞膜上的生长因子受体结合,激活多种生物酶,引发一系列生化反应,刺激细胞的趋化作用、促进细胞有丝分裂,调节细胞蛋白质合成、转换及细胞新陈代谢,完成胶原组织构建,加速溃疡面上皮组织的形成,加快溃疡面愈合速度、提高溃疡面愈合质量[9]。rhEGF能促进上皮细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等多种细胞分化向溃疡面迁移,从而对其愈合发挥重要作用[10]。值得一提的是,rhEGF对细胞外基质也有一定的作用,能减少急性期基质的收缩以及随后的钙蛋白酶所调节的基质松弛[11]。此外,rhEGF还能够激活透明质酸合成酶II,从而增加细胞内外透明质酸的含量。rhEGF不仅能促进皮肤小血管的形成,还可以通过受体酪氨酸激酶(RTK)激活磷脂酶C(PLC)启动肌醇磷脂信使系统,生成前列腺素E,达到扩张血管,增加皮肤血流量,改善皮肤微循环的作用。
银来自天然矿物质,无毒、无味、无刺激、无耐药性和依赖性,是纯天然的抗菌剂。从19世纪开始,人们就开始应用银制剂来治疗绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌引起的感染。银离子在较低浓度时就具有杀灭作用,其机制认为是银离子通过作用于细胞膜,干扰电子运输从而影响细胞内酶的活性、凝固细胞内蛋白质、凝固及破坏DNA分子等多种途径实现对细菌的杀灭作用[12,13]。
纳米银是应用纳米技术将银单质纳米化后形成的超微颗粒,具有稳定的物理和化学性能[14]。由于纳米银的直径(10100nm)明显小于细菌,因此它可以进入菌体内阻断细菌呼吸酶系统,达到杀灭的目的;且纳米银还可以和菌体的DNA碱基结合,并形成交叉链接,置换嘌呤和嘧啶中相邻氮之间的氢键,导致DNA结构变性,抑制其复制,从而阻碍细菌的生存和繁殖;另外纳米银还具有抗炎特性,能减少溃疡创面炎性介质的释放,从而缓解炎症反应[15,16]。本研究中使用的银离子护创液是一种无色无异味透明的液体,由银离子、高分子稳定剂(明胶)及去离子水等制成。该护创液中的银离子对组织及微生物具有强大的渗透性,能与微生物代谢酶中的SH结合,使酶失活,使微生物对葡萄糖、蔗糖的代谢受阻,从而杀灭微生物。当菌体被银离子杀灭后,又有相当一部分银离子从死亡菌体中游离出来,再与其它微生物接触,又杀灭其它微生物,周而复始,这就是为什么该纳米银护创液可保持持久杀菌性能的缘由。此外该护创液中含有医用明胶,而明胶为胶原的变性产物,而胶原又是一种结构型纤维蛋白质,广泛存在于哺乳动物的皮肤、骨骼、软骨和肌腱等组织中,是人体内数量最多的一种天然聚合物,它含有大量的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸,是细胞生长所必需的成分,尤其是脯氨酸有益于营养创面,利于表皮细胞贴壁和增殖,这就是为什么该纳米银护创液对创面的愈合有着良好促进作用的缘由[17]。
通过本次实验研究结果表明,重组人表皮生长因子联合纳米银护创液使用可促进糖尿病溃疡面肉芽组织的形成和再上皮化,减少感染机率,明显缩短溃疡愈合时间,加快溃疡面积缩小速度,显著促进溃疡愈合,从而为今后临床应用治疗糖尿病溃疡提供了实验依据。
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