鱼精蛋白对寡核苷酸复合物的缩合作用及其对转染效果的影响

【摘要】  目的 观察鱼精蛋白对寡核甘酸复合物的缩合效果。方法 用不同浓度鱼精蛋白对寡核甘酸进行缩合,凝胶电泳和扫描电镜观测其缩合结果。将设计的双功能肽与鱼精蛋白和寡核甘酸缩合物进行不同浓度配比后转染脐静脉内皮细胞,激光共聚焦显微镜下观察寡核甘酸入胞效果。结果 在鱼精蛋白与寡核甘酸质量比达到1.6∶1以上时能够明显促使寡核甘酸缩合,扫描电镜下观察发现优于脂质体LipofetamineTM2000对该寡核甘酸的缩合。当功能肽与鱼精蛋白和寡核甘酸缩合物以质量比1∶51∶10配比复合时能够促使寡核甘酸进入脐静脉内皮细胞且转染率较高。结论 优化的双功能肽鱼精蛋白寡核苷酸复合法,能够有效地缩合寡核苷酸,并促进寡核甘酸向脐静脉内皮细胞胞内转移。

【关键词】  双功能肽鱼精蛋白寡核苷酸复合法;缩合;转染;脐静脉内皮细胞

　Abstract:Objective Optimize the nanoparticles construct with MPPProtamineoligodeoxinucleotide,to improve transfection efficiency that Triplex forming oligodeoxinucleotide into human umbilical vein endothelial cell.Methods Synthesize oligodeoxinucleotide labeled by FITC on the 5’ ends.Condensation the oligodeoxinucleotide with different matching Protamine that was evaluated by Gel retardation assay and transmission electron microscop.Construct with MPPProtamineoligodeoxinucleotide and observe their transfection efficiencies in HUVEC by laser scanning confocal microscopy.Results oligodeoxinucleotide can be Condensated into nanometer nanoparticles when the matching of Protamine get to 1.6.MPP match with Protamineoligodeoxinucleotide 1∶10(weight)is higest transfection efficiencies.Conclusion MPPProtamineoligodeoxinucleotide is promising to provide a new safe carrier for the intracellular treatmen.

　　Key words:Membrane permeable peptide(MPP)ProtamineTriplex forming oligodeoxinucleotide;Transfect;Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC);Transfection efficiency

　　如何把有效性基因通过基因转导或转移的方式整合到宿主是基因工程、基因治疗和转基因生物制品的研究重点。非病毒载体法是一种生物性基因转移方法,生物相容性好、基因转移效率高;同时以具有安全性、低毒性、低免疫原性和易操作性等优点逐渐成为大家研究的热点[1,2]。本研究用鱼精蛋白与相应寡核苷酸进行缩合,观察缩合效果;同时将最佳浓度的缩合物通过一定比例与具有穿透细胞膜和穿透核膜功能的双功能融合肽结合,然后以生物性转移的方式把寡核苷酸基因转染脐静脉内皮细胞,取得了满意的转染效果。为今后该类寡核苷酸向胞内及核内转移提供一种新的快捷方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　胎儿脐带(第三军医大学新桥医院妇产科提供)。Ⅰ型胶原酶(Gibco);胎牛血清、RPMI1640培养基(Hyclone);内皮生长因子添加剂(ECGS)、L谷氨酰胺、0.25%胰酶0.02%EDTA消化液(Promega);LipofectameTM2000(Invitrogen);1%硫酸鱼精蛋白(上海第一生化药业);反响嘌呤寡核苷酸(TFO)GT21(上海生物工程公司合成);10OD 27个氨基酸的双功能肽(厦门Pepchem公司合成);扫描透射电子显微镜,激光共聚焦显微镜(LEICA SP2)

　　1.2 鱼精蛋白对TFO G21的缩合及观察

　　将鱼精蛋白与0.5ug的TFO G21分别按照重量比0.2∶1;0.4∶1;0.8∶1;1.2∶1;1.6∶1;2.0∶1;3.0∶1进行混合,室温下放置10分钟,得到缩合物。

　　用1%的琼脂糖凝胶对各缩合样本进行电泳,溴化乙锭染色,80伏,40分钟。凝胶扫描系统观察,找出鱼精蛋白对TFO G21的缩合的最佳的重量配比关系。

　　HEPES液对缩合物样本进行1:5和1:20稀释(体积比),室温下放置5分钟。将稀释液滴加在覆盖聚乙烯醇缩甲醛膜的铜网上,1%磷钨酸负染10分钟,扫描电镜下观察微粒的形态和大小,室温下重复测定3次。设置单纯TFO G21和脂质体LipofectameTM2000缩合两个对照组。

　　1.3 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离培养

　　将取得的胎儿脐带放入生理盐水中,迅速转入培养室超净工作台内,用37℃的PBS液反复冲洗脐带表面直至取出血污,然后剪出脐带中有破损、夹痕或血肿部分,再用37℃的PBS液将脐静脉内残留的血块冲洗干净。钳住脐静脉一端,于另一端处注入0.1%Ⅰ型胶原酶溶液,到管腔充盈为止。来回颠倒数次,置于37℃恒温CO2细胞培养箱孵育15分钟,收集消化液,加入等体积的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中和后离心5分钟(1000转/分钟),去上清,加入上述培养基重复离心一次。得到的沉淀细胞用含10%胎牛血清、30mg/L ECGs和2mmol/L L谷氨酰胺的RPMI1640培养基重悬,调整细胞浓度为5×105接种到培养瓶中。每三天换液一次,待细胞80%融合时,常规胰酶消化,按照1∶3传代培养。

　　1.4 双功能肽携带鱼精蛋白寡核苷酸复合物对转染人脐静脉内皮细胞

　　取4ug TFO G21,鱼精蛋白与TFO G21按2:1的比例缩合。将双功能肽按与TFO G21重量1∶1;2∶1;5∶1;10∶1;20∶1的配比,分别加入鱼精蛋白寡核苷酸缩合物中,室温下放置30分钟。然后把上述复合物加入无血清无抗生素培养一小时的人脐静脉内皮细胞中(六孔板培养),混匀。37%、5%CO2、饱和湿度下培养4小时。更换含10%胎牛血清的培养基继续培养。转染后24小时,丙酮固定封片后激光共聚焦显微镜观察摄取情况。设置双功能肽与TFO G21、单纯TFO G21、鱼精蛋白与TFO G21及脂质体LipofectameTM2000与TFO G21四个对照组。

　　1.5 统计方法

　　结果用t检验对各组间差异进行比较,P<0.05为无明显差异。

　　2 结果

　　2.1 鱼精蛋白对TFO G21的缩合的效果

　　琼脂糖凝胶电泳结果显示,缩合物电泳条带随着鱼精蛋白与TFO G21重量比的增加逐渐变弱。到重量比时1.6∶1以后条带基本消失(图1)。

　　扫描电镜下大体观察,鱼精蛋白与TFO G21缩合组和LipofectameTM2000与TFO G21缩合组在形态上呈圆球形,而单纯TFO G21组则呈不规则的团块状。通过电镜标尺测量单纯TFO G21组粒径平均为400 nm(图2A),LipofectameTM2000与TFO G21缩合组粒径平均为150 nm(图2B),鱼精图2 不同条件下寡核苷酸形态电镜扫描图图1 鱼精蛋白对TFO G21的缩合后琼脂糖凝胶电泳图

　　2.2 人脐静脉内皮细胞的获得

　　通过0.1%Ⅰ型胶原酶消化法获得了原代细胞。在传代培养中观察发现,第三代和第四代HUVEC生长状态稳定生长速率适宜未见明显老化和细胞相关形状改变。

　　2.3 双功能肽携带鱼精蛋白寡核苷酸复合物转染人脐静脉内皮细胞的结果

　　转染后观察结果显示,双功能肽鱼精蛋白TFO G21复合物(10∶2∶1和20∶2∶1)转染组HUVEC转染率都在70%左右且转染遍布整个细胞的胞浆并进入胞核(图3A);双功能肽鱼精蛋白TFO G21复合物(5∶2∶1)转染组HUVEC转染率在40%左右且转染遍布胞浆及胞核;双功能肽鱼精蛋白TFO G21复合物(2∶2∶1和1∶2∶1)转染组HUVEC转染率较低;脂质体LipofectameTM2000与TFO G21转染组转染率在50%左右,转染物仅位于胞浆而未进入胞核(图3B);双功能肽与TFO G21转染组转染率在20%30%左右,分布于胞浆和胞核;单纯TFO G21组。

　　3 讨论

　　传统的基因转移方法,如:物理法、化学法及病毒载体法对细胞都有一定的损害和影响不能进一步用于体内治疗[3]。如何把功能性寡核苷酸GT21导入细胞内甚至细胞核内才能实现其抑制作用是亟待解决的问题。

　　鱼精蛋白作为一种聚阳离子,可以使DNA分子链塌陷成紧密有序地纳米微粒,从而使得由原来稀疏地占有很大体积的无规卷曲状态缩合为紧密包装的、高度有序的状态。此外,鱼精蛋白是由海洋鱼类提取的天然产物,长期临床应用安全性好[4]。更主要的是鱼精蛋白富含精氨酸残基具有强碱性带正电荷,能够和双功能肽的N末端结合并带有特定的核定位信号[5,6]。本实验数据表明GT21在鱼精蛋白的缩合下形态由不规则的团块状改变成有极性的圆球形;且鱼精蛋白与TFO GT21重量比达到1.6∶1.2∶1时能够到达完全有效的缩合,效果优于LipofectameTM2000对TFO G21的缩合。

　　双功能肽是一个由27个氨基酸组成的寡核苷酸,它具有两个独立的功能区域。C段为疏水区,由TAT蛋白结构中一段(HIV GP41)构成,有穿透细胞脂质双分子层的功能[7,8];N端是亲水性末端,来源于SV40大抗原的核定位信号(NLS),富含精氨酸,在生理条件下可与鱼精蛋白等聚阳离子共价结合,共同具有核定位功能[9]。

　　选择人脐静脉内皮细胞作为转染观察的细胞模型,通过鱼精蛋白的缩合寡核苷酸GT21形成纳米微粒,并在鱼精蛋白和双功能肽的引导作用下能够很好的达到入胞和入核的结果,从而有效地发挥阻断动脉血栓的功效。并且该方法简便易于操作,制作费用低,生物安全性好,便于推广,这为我们今后该类药物治疗提供了新的方法和途径。图3 不同缩合物转染效率激光共聚焦检测图

【参考文献】
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　　[3] 刘勇,杨在亮,李黔宁.基因转移技术现状及发展[J].西北医学,2008,20(6):12881290.

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　　[8] Matsui H,Tomizawa K,Matsushita M.Protein transduction by polyarginine[J].Nippon Yakurigaku Zasshi,2003,121(6):435439.

　　[9] Kalderon D,Richardson W D,Markham A F,et al.Sequence requirements for nuclear location of simian virus 40 largeTantigen[J].Nature,1984,311:3338.