组织工程人工神经对大鼠坐骨神经缺损后神经再生速度的影响

【摘要】  目的 研究组织工程人工神经对大鼠坐骨神经缺损后神经再生速度的影响。方法 建立15mm的SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型后,用嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OEC),雪旺氏细胞(Schwann cells,SC),细胞外基质成份(extracellular matrix,ECM)以及自行制备的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(poly(DLlactidecoglycolide),PLGA)导管,构成OECSCECMPLGA桥接体进行修复,同时设OECECMPLGA组、SCECMPLGA组、ECMPLGA组、PLGA组和自体神经移植组进行对照。在术后1,3,6,9周行神经再生速度检测。结果 术后1、3、6w,由于新生神经纤维无法着色而无法计算神经再生速度,术后9w,OECSCECMPLGA组和自体神经移植组的神经再生速度均为(0.71±0.00)mm/d,显著快于OECECMPLGA组的(0.60±0.05)mm/d和SCECMPLGA组(0.60±0.09)mm/d(P<0.05)。ECMPLGA组和PLGA组神经再生速度均为零。结论 OECSCECMPLGA桥接体可显著提高大鼠坐骨神经缺损后神经再生速度。

【关键词】  组织工程人工神经;嗅球成鞘细胞;雪旺细胞;坐骨神经缺损

　Abstract:Objective To explore the effect of tissueengineering artificial nerve on neuroregeneration speed after rat sciatic nerve defect.Methods The 15mm SD rat right sciatic nerve defect model was established and repaired with OECSCECMPLGA bridging complex,which contained OEC,SC,ECM,and selfmade PLGA conduit.At the same time,OECECMPLGA group,SCECMPLGA group,ECMPLGA group,PLGA group,and nerve autograft group were also set up as the controls.At 1th week,3th week,6th week,9th week after surgery,the neuroregeneration speed test were performed.Results From 1 weeks to 6 weeks after surgery,it is impossible to calculate the neuroregeneration speed.From 6 weeks to 9 weeks after surgery,the neuroregeneration speed of OECSCECMPLGA group and nerve autograft group were(0.71±0.00)mm/d,which were faster than that of OECECMPLGA and SCECMPLGA groups(P<0.05).Conclusions OECSCECMPLGA bridging complex can significantly enhance the neuroregeneration speed after rat sciatic nerve defect.

　　Key words:tissueengineering artificial nerve;OEC;SC

　　组织工程人工神经的应用极大的提高了神经缺损的修复效果,先前的研究已经初步阐明了构建的组织工程人工神经OECSCECMPLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损的解剖学修复作用[1],及对外周靶器官与脊髓神经元的保护作用[2]。本文将探讨OECSCECMPLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损后神经再生速度的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 OEC和SC的分离培养及鉴定、PLGA导管的制作、OEC和SC的预标记,动物的类型(品系)、数量及来源,动物模型的建立及分组,按文献[13]介绍的方法进行。

　　1.2 神经再生速度的测定

　　术后1,3,6,9周,30 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后,取材桥接管内再生组织,冰冻纵行切片,片厚10 μm,PBS漂洗3次×5 min,封闭山羊血清室温下孵育20 min,加入小鼠抗大鼠NF200单克隆抗体(Sigma,1∶1000)一抗工作液,37℃孵育3h,PBS漂洗3次×5 min,加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probe,1∶50)二抗工作液37℃孵育30min,PBS漂洗3次×5 min,荧光显微镜FITC模式下测量桥接体内NF200标记的再生神经纤维向远端桥接点方向所能到达的最远距离,再根据时间计算出神经纤维的再生速度。

　　1.3 统计学分析

　　数据以±s表示,应用SPSS10.0软件,采用单因素方差分析Turkey法进行多样本均数的两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　根据神经微丝(neurofilament,NF)对神经纤维的显示性,利用免疫组化的方法,在荧光显微镜下测定再生神经微丝所能到达的最远距离,即神经纤维所能到达的最远距离,再根据时间计算神经纤维再生速度。术后1、3、6 w,NF200免疫组化染色不能着色,因而神经再生速度无法计算,这可能和再生的神经纤维较为幼稚有关。术后9w,OECSCECMPLGA组和自体神经移植组神经纤维到达的最远距离为(15.00±0.00)mm,显著远于OECECMPLGA组的(12.60±1.14)mm和SCECMPLGA组的(12.60±1.95)mm(P<0.05),这些数据被时间21d除,得到OECSCECMPLGA组和自体神经移植组的神经再生速度均为(0.71±0.00)mm/d,显著快于OECECMPLGA组的(0.60±0.05)mm/d,SCECMPLGA组(0.60±0.09)mm/d(P<0.05)。由于ECMPLGA组和PLGA组去除神经支架后近端可见细小锥状突起,经HE染色证实无神经组织成分,故其神经再生速度均为零。图1 术后9w自体神经移植组NF200免疫组化染色结果

　　3 讨论

　　人工神经对神经再生的诱导、促进和规范作用正是通过种子细胞自身或其分泌的神经营养因子而实现的,因而种子细胞是人工神经的核心部份。从可查阅到的文献来看,以往应用的种子细胞有SC、OEC、骨髓基质细胞和神经干细胞等。近来研究发现,成年哺乳动物的嗅神经系统是极少数可以再生的中枢神经系统之一,其再生能力与嗅球的一种胶质细胞 — OEC密切相关。OEC是一类介于SC和星形胶质细胞之间的特殊类型的胶质细胞,主要分布在嗅球的嗅神经层和颗粒层),能支持嗅神经的终生存活和再生。在嗅神经的再生过程中OEC不仅可诱导再生神经纤维长入中枢的嗅球,也对其具有机械保护作用,而且可表达各种神经营养因子等神经营养物质,也能合成L1和神经细胞粘附分子等有益于轴突再生的物质,同时分泌层粘连蛋白、纤维连接蛋白、IV型胶原等细胞外基质成分。这些物质无疑为OEC修复周围神经缺损提供了良好条件。OEC的神经再生修复作用可概括为髓鞘再形成、重建朗飞氏结、促轴突再生、增强可塑性、募集内源性雪旺细胞、远距离抑制皮层运动神经元凋亡等[4]。更令人振奋的是,OEC能够减少硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的分泌以及穿越胶质瘢痕而发挥修复作用[5]。

　　SC是周围神经的成髓鞘细胞,被最早用于构建人工神经,在外周神经修复中具有举足轻重的作用[6]。鉴于OEC和SC的这些特性,我们研究发现OEC和SC两种种子细胞联合的人工神经修复坐骨神经缺损的效果优于单细胞移植,但其中任何一种细胞移植的修复效果都比无细胞移植组好[1,2]。而神经再生速度可以定量地观察移植细胞的促神经再生效果,从另一个侧面印证了我们先前的结果,术后9w,OEC和SC联合应用其神经再生速度可以达到自体神经移植一样的效果,显著快于单独应用,但任何一种细胞的应用其神经再生速度显著快于无细胞移植,这可能和OEC和SC促神经再生的协同作用有关[1]。

【参考文献】
  　[1] 游华,矫树生,冯帅南,等.OECSCECMPLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损的解剖学修复作用[J].第三军医大学学报,2008,30(21):20152019.

　　[2] 游华,矫树生,冯帅南,等.大鼠坐骨神经缺损后组织工程人工神经对外周靶器官及脊髓神经元的保护作用[J].中华创伤杂志,2010,26(3):265269.

　　[3] 游华,矫树生,陈建梅,等.嗅球成鞘细胞的分离培养与鉴定[J].现代生物医学进展,2008,8(1):1012.

　　[4] Dombrowski MA,Sasaki M,Lankford KL,et al.Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells[J].Brain Res,2006,1125(1):18.

　　[5] Lindsay SL,Riddell JS,Barnett SC.Olfactory mucosa for transplantmediated repair:a complex tissue for a complex injury[J].Glia,2010,58(2):125134.

　　[6] 矫树生,李兵仓.周围神经组织工程中种子细胞的最新研究进展[J].中华神经医学杂志,2007,6(5):528530.