ECM修复兔桡骨缺损的实验研究

【摘要】  研究自制的兔耳廓脱细胞软骨基质（extracellular cartilage matrix，ECM）修复骨缺损的特点及机理。［方法］采用新西兰大白兔共40只，随机分A、B两组，在其两侧桡骨干中段制作5 mm的骨缺损模型。右侧作为实验侧，缺损区A组植入脱细胞软骨基质复合自体培养骨髓干细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，左侧为空白对照。分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。［结果］X线及组织切片均证实复合体在6周时已有致密骨组织形成，10周时已有新生髓腔生成。［结论］表明兔耳廓脱细胞软骨基质与自体骨髓干细胞复合体有良好的成骨能力，有引导组织再生、防止骨不连作用。

【关键词】  骨缺损 骨移植 脱细胞软骨基质 软骨细胞

    Bone defect repair using allogenic ECM combined with chondrocytes in rabbits∥LIU Junbin,QI Xiangtong.Orthopedic Department,the First Peoples Hospital,Jining,Shangdong 272000,China

    Abstract：［Objective］The characteristics and mechanism of the bone defect repair with the using allogenic extracellular cartilage matrix（ECM）were studied.［Method］Forty New Zealand white rubbits were divided into three groups at random:A and B on the right side,the defect was covered with the complex of ECM and autologous mesenchymal stem cells（MSCs）,the ECM in the groups A and B,respectively.The defects on the left side served as controls correspondingly.The rabbits were killed at the 2nd,4th,6th,10th week.Samples were taken for radiological and histological studies.［Result］In the experimental sides the bone defects were healed.New bone appeared in the way of intramembranous ossification and entochondrostosis.［Conclusion］It is suggested that the complex of ECM and autologous MSCs has the effects on guiding bone regeneration and preventing from nonunion.

    Key words:bone defect;  bone grafting;  extracellular cartilage matrix（ECM）;  chondrocyte

    临床上长段骨缺损造成的骨不连较常见。骨缺损的修复材料很多，自体骨移植修复效果虽理想，但其来源有限。如何选择一种材料来提高骨缺损修复效果，这是人们正在研究的重点。作者采用经胶原酶-去垢剂处理，去除抗原性成分的兔耳廓软骨复合自体软骨细胞植入兔桡骨干缺损，分别于2、4、6、10周观察骨的修复能力。具体报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    新西兰大白兔（购自华中科技大学同济医学院动物试验中心），共40只，均为雄性，月龄为2~3个月，体重2.0~2.5 kg。

    1.2  兔耳廓ECM的制备

    切取2月龄兔的双侧耳廓，去除皮肤及软骨膜，新鲜软骨用PBS液冲洗3遍，采用去垢剂酶四步法〔1〕对软骨进行脱细胞处理：（1）将新鲜软骨置入Tris低渗缓冲液中，缓冲液中含有蛋白酶阻断剂，4 ℃恒温震荡48 h；（2）1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48 h后，以蒸馏水连续冲洗24 h；（3）DNase Ⅰ和RNase Ⅰ混合后，在37 ℃下消化2~4 h：（4）再次用1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48 h，取出后所有标本用DHanks生理盐溶液4 ℃下彻底清洗24~48 h。完成了对软骨脱细胞处理后，置于无菌PBS液中保存备用。

    1.3  骨髓干细胞的分离和培养

    按Kadiyala等〔2〕描绘的方法，取健康2个月龄新西兰大白兔，氯胺酮和异丙嗪肌注麻醉，双侧髂部剪毛后碘伏消毒，在无菌条件下用16号骨穿刺针在髂骨翼外侧穿入骨髓腔，注射器针管内预先含有0.1 ml肝素钠生理盐水，抽吸骨髓液6 ml移入Mc5A培养液5 ml的离心管内混匀，1 500 r／min离心5 min，弃上层脂肪和上清。加入适量无血清培养液悬浮细胞，缓慢移入盛有比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中（细胞培养液与细胞分离液之比1∶1），以2 000r／min离心20 min，小心吸取界面的有核细胞乳白层，加入Mc5A培养液10 ml，制成细胞悬液移入25 cm2培养瓶中，置于37 ℃ 5％CO2及饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜下观察呈形态一致的均质的分布均匀的细胞，可用于MSCs收集和移植〔4、5〕，计数每瓶中含有细胞1.5×105个／ml时，收集的骨髓MSCs低温存储中。

    1.4  动物模型的制备

    2~3个月龄的新西兰大白兔40只，均为雄性，体重2.0~2.5 kg，随机分为2组，每组20只，在其双侧桡骨中段，咬去5 mm桡骨造成骨缺损模型，右侧作为实验侧，左侧为空白对照，A组中右侧缺损区植入脱细胞软骨基质复合自体培养软骨细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。

    1.5  放射学检查

    术后第4、6、10周分别于同样条件下拍X线片观察骨缺损修复情况。因为ECM不显影，如果出现密度增高影即表示有新骨形成。对12周的X线片根据骨缺损内生骨面积行X线等级疗效评估〔3〕。100％为5分，75%~99％为4分，50%~74％为3分，25％~49％为2分，1%~24％为1分，0为0分。

    1.6  组织学观察

    分别于第2、4、6、10周各处死动物，取双侧修复的，将尺桡骨分离，福尔马林固定1周，尔后分离出桡骨，以原缺损区为中心切取桡骨10 mm，作为组织学切片检查，HE染色。

    1.7  数据统计学分析

    数据用x-±s表示，采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  放射学检查

    A组实验侧（复合体侧）：第4周时出现点状阴影，部分出现毛玻璃阴影；6周时阴影密度增大，有大片钙化，骨量增加；10周已完全骨性连接，大部分出现不规则骨髓腔，可见少量骨髓腔相通（图1、2）。B组实验侧（ECM植入侧）：4周后未见明显钙化影；6周时亦见少部分骨连接，钙化影增宽；10周时骨缺损处有较多的钙化，骨量增加，均都部分骨性连接，一部分出现不规则髓腔（图3、4）。C对照组10周时缺损区仍无新骨形成（图5、6）（表1）。 表1  兔桡骨干骨缺损治疗10周时X线片疗效评分结果A组实验侧（复合体侧）：术后2周可见编织骨和成团的软骨细胞，炎性细胞较少，并可见丝团状的纤维蛋白以及增生的小动脉，有纤维骨痂形成，新的骨小梁开始出现；4周时编织骨量增加明显，呈灶状；6周时出现大量新生致密的骨组织，编织骨逐渐吸收降解，极少数软骨细胞与纤维组织充填骨缺损区、10周时形成皮质骨和成熟骨髓，伴随骨痂生长，可见骨髓腔相通（图7）。B组实验侧（ECM植入侧）：2周时有较多软骨细胞及纤维组织及少量炎性细胞；4周时出现少量新生骨，未见髓腔出现；6、10周时出现交织骨，有少许不规则髓腔，但仍见软骨细胞（图8）。C组对照组10周后大部分仍可见有缺损，少量地填充肉芽组织（图9）。

    2.3  骨小梁形态计量分析

    A组实验侧（复合体侧）新生骨小梁面积（17.43±4.58）mm2，高于B组实验侧（ECM植入侧）新生骨小梁面积（11.92±3.19）mm2，有显著性差异，具有统计学意义（t=5.59，P＜0.05）；而A组实验侧和B组实验侧与C组对照侧（8.25±5.33）的新生骨小梁面积相比较具有显著性差异，具有统计学意义（t=6.68，P＜0.001；t=9.56，P＜0.05）。

    3  讨  论

    3.1  概  述

    骨缺损的修复方法很多，有自体骨移植、异体骨移植、人工骨移植等，最理想的修复方法是自体骨移植，但是受到供体的限制。近几年来，长段骨缺损修复研究越来越多，用于细胞种植的骨移植材料可分为人工和天然两种，人工材料具有较好的生物相容性、可降解性及可吸收性，但费用昂贵，降解率可塑性低，特别是其酸性代谢产物会降低聚合物周围的pH值，从而影响细胞核组织生长〔4〕，还可以引起纤维化及可能发生周围组织的免疫反应〔5〕；天然材料有同种异体骨、异种骨等，作者使用异体软骨通过脱细胞处理后制作的细胞外软骨基质（extracellular cartilage matrix，ECM）来修复兔的桡骨5 mm缺损，观察其修复的效果。结果表明：ECM复合骨髓基质干细胞（A组）效果最好，其次为B组，较差的为C组，说明ECM可作为骨缺损的修复组织材料，亦可作为细胞培养支架材料。

    3.2  ECM的组织结构

    ECM只起支持保护细胞和维持渗透压的作用。近年来，细胞外间质的研究发展非常迅速。现在研究认为ECM是个“蛋白信使”丰富的环境，并且软骨细胞与ECM的相互作用调节了许多生物学过程，这包括了细胞的黏附、生长、分化及生存〔6〕。

    ECM生物材料有以下优点：（1）经过去污剂酶四步法处理制作，去除了软骨组织的细胞成分，从而去除了存在于有核细胞膜上的主要组织相容性抗原，避免了组织排斥反应。（2）ECM主要成分为胶原、弹性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖，这些成分有较好的亲水性。（3）ECM具有一定生物活性，促进骨髓基质干细胞的增殖、分化等。本试验中异体ECM在体内的转归有2种结局：（1）异体ECM部分吸收缩小，在复合自体骨髓干细胞的修复组织中，骨髓干细胞在材料支架中迁移、分化和增殖；（2）骨髓干细胞自身分泌一些活性物质，激发其向软骨细胞及骨细胞转化，从而形成新生骨组织。

    3.3  骨缺损研究发展方向

    骨髓基质干细胞能够向成骨细胞转化，具有明确的成骨能力。但是单体内植入细胞并不能有效地形成新的组织，其主要原因在于以液态形式注入体内的细胞在局部微环境的作用下，无法保持局部有效浓度，导致新生组织数量下降。在组织工程化新生骨组织的发生过程中，生长因子不仅能够发挥诱导成骨作用，也能够促进种子细胞的增殖分化，直接推动骨组织的形成〔7〕。骨缺损移植ECM作为支架，其成骨来源于宿主骨周围的骨膜〔8〕，成骨活动以软组织侵入和形成骨吸收陷窝，陷窝内的破骨细胞和成骨细胞来源于移植骨质周围的骨髓干细胞〔9〕，吸收和重建同时进行。陷窝逐渐形成管状结构，周围有新骨形成，可以观察到活跃的骨诱导成骨现象。移植后4周可形成较为坚强的骨外痂，该结合部的主要愈合表面，特别是在骨移植早期为主要的愈合方式。

    图1A组实验侧（复合体侧）：10周后标本显示骨缺损已完全骨性连接，外形平滑，骨质比较坚硬  图2A组实验侧（复合体侧）：10周时阴影密度增大，有大片钙化，骨量增加，已完全骨性连接，大部分出现不规则骨髓腔，可见少量骨髓腔相通  图3B组实验侧（ECM植入侧）：10周时骨缺损处有较多的钙化，骨量增加，均都部分骨性连接，周围仍有少部分纤维肉芽组织  图4B组实验侧（ECM植入侧）：10周时骨缺损处有较多的钙化，骨量增加，均都部分骨性连接，一部分出现不规则髓腔  图5对照组：10周时缺损区大部分为纤维肉芽组织，无明显新骨形成  图6C对照组：10周时骨缺损区显示仍无新骨形成  图7A组实验侧（复合体侧）：10周时形成皮质骨和成熟骨髓，伴随骨痂生长，可见骨髓腔相通  图8B组实验侧（ECM植入侧）：10周时出现交织骨，有少许不规则髓腔，但仍见软骨细胞  图9C组对照组：10周后大部分仍可见有缺损，少量地填充肉芽组织    目前公认的骨缺损模型为桡骨中段大于1.0 cm阶段性缺损。Johnson等〔10〕指出实验性骨缺损需要在一些不利于骨生长的环境中进行，如果骨缺损超过骨干直径3～4倍，即不能自行修复，因为骨局部肌肉覆盖较少，红骨髓含量少等。在短期内恢复骨的支撑作用，又可以经过一定时间的融合、再塑而实现与宿主骨相同的形态和功能。

    本试验的结果表明兔耳廓ECM与自体骨髓干细胞复合体或单纯的ECM来修复兔桡骨缺损比空白对照组相比具有良好的成骨能力，说明ECM可以作为骨缺损修复的理想的修复材料，它的优点：取材容易，制作简单，组织相容性良好，如果对此材料进一步深入的研究和在制作上进一步的改进，将大大地提高使用价值。

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作者单位：济宁市第一人民医院骨科，山东济宁 272000