出生后不同发育时期大鼠基底前脑雌激素β表达的免疫组织化学研究

【摘要】  目的 研究雌激素β受体(estrogen receptor,ERβ)在出生后不同发育时期大鼠基底前脑内表达的变化。方法 硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学技术。结果 在两性大鼠,出生之日(P0)时均未见ERβ蛋白表达,P3后开始出现散在的阳性细胞。随后在两性大鼠基底前脑ERβ的表达增加,在P14～1月龄达到高峰,然后略有下降,但仍保持较高水平,一直到12月龄。到老年时,表达明显减弱,甚至消失。雄性的ERβ免疫反应性强于雌性。阳性物质主要位于细胞核,但在大鼠基底前脑也可见到阳性物质位于细胞浆的情况。结论 ERβ的上述表达模式与性别差异提示该受体可能参与了对基底前脑胆碱能神经元发育和功能的性别差异性调节。ERβ免疫阳性产物也可位于细胞核以外的部位，提示它可能在发育的特定时期还具有非基因型调节效应,即通过第二信使途径调节胆碱能神经元的结构与功能。

【关键词】  雌激素受体;基底前脑;性别差异

　【Abstract】 Objective To investigate the expression and sex differences of estrogen receptor beta(ERβ)in the basal forebrain of male and female rats.Methods Nickelintensified immunohistochemistry.Results In P0 rats no ERβ immunoreactivities were detected,it appeared from P3 then increase until P30,after that it decreased but remained high levels until 12 months old,while in the old basal forebrain ERβ immunoreactivities decreased significantly.Similar profile was also detected in the females but with less stronger ERβ immunopositive reactivity.The immunopositive materials were predominantly detected in the cell nuclei but also in cytoplasm.Conclusion The above mentioned profile of ERβ in the basal forebrain of both male and female rats indicating its potentiate role in the regulation of cholinergic neurons with sexdifference.Furthermore,this nuclear receptor may also function with nongenomic regulatory pathway besides its classic genomic regulation.

　　【Key words】 Estrogen receptor;Basal forebrain;Sex difference

　　雌激素在脑内具有多方面的作用，是由其受体(estrogen receptor,ER)介导的。目前已经发现了多种ER,即“经典的”α受体(ERα)和β受体(ERβ)以及雌激素膜性受体(G protein coupled estrogen receptor,GPER)[13]。脑内ERβ对学习记忆、应激等具有重要的调节作用,ERβ表达见于与学习记忆有关的脑区如基底前脑、大脑皮质和海马[4]。我们先前研究了ERβ成年大鼠脑内表达的性别差异,认为该受体可能是介导雌激素调节学习记忆的功能性受体[5]。近年基因敲除实验证实了ERβ在学习记忆过程中发挥了重要作用[6，7],然而其机制尚不清楚,因此对脑内ERβ的表达与功能研究具有重要的理论和临床意义。

　　基底前脑包括隔内侧核(medial septal nucleus,MS)、斜角带垂直部背侧部(vertical band of Diagonal band,dorsal part;VBDD)和垂直部(vertical band of Diagonal band,ventral part;VBDV)、斜角带水平部(horizontal band of Diagonal band;HBD)以及嗅结节岛(Calleja island,IC)等部位,其纤维投射到大脑皮质与海马等部位。研究发现基底前脑含有大量的胆碱能神经元,这些神经元参与了学习记忆和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等神经退行性疾病的发病过程[8]。我们先前的研究发现成年大鼠基底前脑内ERβ的表达相当高并报道了小鼠基底前脑内ERβ的发育学表达以及循环雌激素对其表达的影响[9,10],但其在大鼠出生后不同时期基底前脑内的发育学表达变化以及性别差异并不清楚。为此，我们应用免疫组织化学技术研究了ERβ在大鼠出生后不同发育时期基底前脑的表达与性别差异,以期为研究雌激素作用于基底前脑神经元的基础研究提供更多的资料。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　SPF级雌雄Wistar大鼠购自本校实验动物中心。出生之日为P0,以此类推。取P0、P3、P7、P14、1月龄、3月龄、12月龄、18月龄动物,每组3只;成年动物经阴道涂片证实为动情间期。除出生后早期动物经麻醉后直接断头取脑外行浸泡固定外,其余均经灌注固定。

　　1.2 主要试剂和药品

　　兔抗ERβ多克隆抗体(sc8974)购自Santa Cruz公司;生物素化羊抗兔抗体(ZB2010)与辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素复合物(ZB2404)、封闭血清、DAB等购自北京中杉公司;其余试剂均为市售分析纯。

　　1.3 动物固定、取材

　　5%水合氯醛麻醉后开胸,经左心室插管到主动脉,剪开右心耳,先后灌注生理盐水200 ml和4%多聚甲醛溶液300 ml,灌注后取出前脑组织(至下丘脑为界),用4%多聚甲醛后固定过夜,然后换30%蔗糖溶液脱水至组织块沉底。脑组织经OCT包埋后进行连续冰冻切片(片厚30 μm),每隔6片收集一片于含4%多聚甲醛溶液的6孔培养板内备用。

　　硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法参照文献[5，9，10]进行。切片经磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次后用3%过氧化氢溶液孵育15 min,然后用PBS漂洗3次,切片入5%正常羊血清孵育30 min,倾去血清后切片与兔抗ERβ抗体(1:200)于4℃孵育24 h。PBS漂洗后用二抗(1:200)于室温孵育1 h,PBS漂洗后用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素复合物(1∶200)室温孵育1 h。PBS漂洗后用硫酸镍铵DAB显色法室温显色5 min后用PBS终止显色,裱片后于60℃烘烤过夜然后用二甲苯透明、DPX封片。阴性对照操作同前,但用PBS代替一抗。

　　1.4 数据统计

　　脑核团的定位于显微镜下结合Paxinos等的The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(2007,第六版)进行,用奥林巴斯DX60显微摄像系统采集数码图像。各核团内ERβ免疫反应的强弱根据每只大鼠同一脑区3～5张切片、5只大鼠共计15～25张切片的染色水平综合判断,以++++、+++、++、+和表示,分别代表最强、强、中等、低和无明显表达。

　　2 结果

　　与一般的DAB/H2O2显色结果(棕黄色)不同,采用硫酸镍铵增强的免疫组织化学显色结果为蓝黑色沉淀。结果发现ERβ免疫阳性产物主要位于细胞核,但在特定时期也可在细胞浆甚至突起中检测到。由于嗅结节岛内ERβ蛋白的表达较低,因此我们主要观察了MS、VBD和HBD内ERβ蛋白的表达情况。P0:此时两性大鼠基底前脑内未见ERβ蛋白表达。P3:雄性在VBDD有少数的阳性细胞核散在分布(图1A),雌性仍未见表达。P7:雄性HBD出现阳性细胞,同时MS内也出现少数的阳性细胞(图1B)。雌性的VBD背侧有较多的阳性细胞,MS只有散在的阳性细胞核。P14:雄性的HBD、VBD腹侧可见很强的表达(图1C),VBD背侧和MS内的表达较弱。雌性的HBD表达最强(图1D),其次为VBD背侧部。MS和VBD腹侧表达较微弱。大部分的阳性细胞可见深染的细胞核与浅染的突起,个别细胞为细胞核阴性而细胞浆与突起着色。雄性的表达明显强于雌性。1月龄:基底前脑各部位均有ERβ蛋白表达。在雄性,VBD背侧部的表达最强,其次为腹侧部、MS和HBD(图1E),为单纯的细胞核阳性。在雌性大鼠,MS表达最强,其次为HBD、VBD,细胞核着色深,呈清晰的点状。3月龄:在雄性,VBD腹侧表达最高,MS次之,HBD和VBD背侧部较弱。在雌性大鼠,仍然是MS内表达最高,HBD、VBDV次之(图1F)。阳性物质均位于细胞核。12月龄:阳性信号明显较3月龄时减弱。雄性主要见于VBD,其中背侧部强于腹侧部;隔内侧核内阳性细胞减少,HBD内更少。雌性则以VBD表达最强,MS次之,HBD内只有少数散在的阳性细胞。18月龄:免疫阳性信号进一步减弱。雄性仅仅在MS内有一些阳性细胞(图1G),其余部位基本消失。雌性为MS强于VBD,阳性细胞数量多,但信号强度明显减弱。其余部位基本上未见阳性反应。以上结果总结见表1.表1 生后不同发育时期大鼠基底前脑内的ERβ免疫反应性图1 硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法研究ERβ在出生后不同发育时期大鼠基底前脑内的表达

　　3 讨论

　　应用硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法,我们首次观察了ERβ蛋白在大鼠基底前脑的发育学表达,实验结果表明基底前脑内ERβ的表达具有明显的性别差异,即出生后早期和老年时雄性强于雌性。其次,从发育学表达图谱来看,新生时基底前脑ERβ蛋白表达较低甚至缺如,随后逐渐增强,出生后第14天～3月龄时达到高峰,然后逐渐下降,老年(18月龄)时表达显著降低,在某些部位甚至消失,尤其在雌性更明显。以上结果与我们对小鼠基底前脑ERβ表达的性别差异研究[9]基本一致,提示ERβ对基底前脑神经元的发育、分化和性别差异可能具有重要的调节作用。

　　哺乳动物脑在结构、功能和行为等多方面都存在性别差异,如与生殖功能有关的内侧视前区(medial preoptic area,POA)的体积是雄性显著大于雌性[11]、AD的发病是女性多于男性而PD和老年性耳聋等则是男性多于女性[12]等,造成这些差异的分子机制尚不清楚。研究发现,无论是外周来源的雌激素还是脑局部合成的雌激素都对脑的性分化(包括神经发育、神经元迁移或存活)具有很重要的作用,尤其是在发育阶段。如在新生时向雄性小鼠POA注射芳香化酶(雌激素合成酶)抑制剂或芳香化酶反义寡核苷酸,成年后雄性小鼠POA的体积则显著减小;若向雌性小鼠POA注射芳香化酶激动剂,成年后雌性小鼠POA的体积则显著增加。

　　ERβ在脑内具有多方面的重要功能,尤其是学习记忆等高级功能。Liu等[6]采用药理学、形态学、分子生物学、生物化学与行为学等方法,证明雌激素对海马突触可塑性和记忆受ERβ的调节。ERβ激动剂能促进突触可塑性的关键蛋白PSD95、突触囊泡素(synaptophysin)和AMPA受体亚单位GluR1的表达,敲除ERβ基因后上述效应被抑制;海马脑片实验表明ERβ激动剂能增强LTP,这也能被ERβ基因敲除所抑制。ERβ活化能诱导海马神经元形态的改变,如促进树突分枝、增加树突棘密度等。Srivastava等[7]发现ERβ活化能增加皮质神经元树突棘密度并促进PSD95的表达、诱导细胞浆内PSD95迁移到突触后致密物从而形成脚手架样结构以锚定GluR1等突触可塑性蛋白,其分子机制涉及到诱导p21活化的激酶(p21activated kinase,PAK)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化,提示ERβ的活化与细胞骨架的调节相关,表明ERβ通过PAK/ERK1/2依赖的信号途径快速调节神经元形态。另外,活化ERβ与降低焦虑有关[13]。在胚胎发育时期,ERβ影响皮质分层与中间神经元的迁移、因此对脑的形态发生极为重要[14]。另外,ERβ的表达在很多脑区如下丘脑、中脑等都有性别差异[16,17]。

　　基底前脑在学习记忆中有核心作用。研究发现基底前脑含有大量的胆碱能神经元,已经证实这些神经元参与了学习记忆和AD的发病过程,雌激素通过调节胆碱能神经元内的已酰胆碱而增强认知功能,给予雌激素可以改善胆碱能神经元的功能,如促进胆碱能神经元ChAT的表达。基底前脑胆碱能神经元是海马、大脑皮质核杏仁复合体主要的胆碱能来源,对认知、注意行为有重要意义,在AD中出现功能障碍。这些神经元具有胆碱能的各种标记物,也有神经生长因子受体、钙结合蛋白、谷氨酸受体以及雌激素受体(ERα和ERβ)。一些中间神经元则含有m型乙酰胆碱受体(mAChRs)、 NADPH黄递酶、γ氨基丁酸(GABA)以及一些抑制性神经肽如甘丙肽(galanin,在AD中有过表达)。研究发现AD患者基底前脑谷氨酸受体GluR2与钙结合蛋白的表达失衡,提示在老化过程中这些分子可能协同性诱导兴奋性毒性细胞死亡。 基底皮质系统的ChAT活性与胆碱能神经元数量在AD早期数量比较稳定,而在晚期患者隔海马区则上调;NGF阳性神经元在发病早期即减少,晚期患者则出现trkA mRNA表达减少但p75(NTR)维持不变,表明在AD的进程中伴有基底前脑神经营养的缺失[8]。

　　目前对基底前脑ERβ的研究报道不多。我们曾报道了该部位ERβ蛋白的表达[5,9，10],Milner也报道ERβ见于基底前脑[4],BlurtonJones等[15]发现基底前脑ERβ可位于抑制性神经元,提示ERβ可以调节神经元兴奋性。以上研究表明ERβ对基底前脑神经结构与功能的保持具有重要的意义。由于基底前脑是AD的主要受累脑区,AD患者的基底前脑出现老年斑(β淀粉样蛋白沉积)、神经原纤维缠结和胆碱能神经元丢失等病理改变。目前研究认为,在老化过程中,随著卵巢功能的丧失,循环雌激素水平下降,导致基底前脑胆碱能神经元功能下降,可能是造成老年性痴呆等神经退行性疾病的重要原因。尽管对雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy,ERT)在AD中的作用还有争议,但是大量的研究还是表明ERT可有效地缓解上述症状从而改善AD的痴呆症状、预防或推迟AD的发生,其机理尚不清楚。我们发现ERβ蛋白表达的上述变化趋势与循环雌激素水平下降的趋势基本一致,表明老年后雌激素对基底前脑的作用减弱,其原因可能是由于ERβ蛋白的表达减少所致。由于雌性鼠的减弱较雄性显著得多,因而上述发现或许可以解释为何AD患者多为女性的原因,因此深入研究基底前脑内ERβ的功能与性别差异研究具有重要的理论和临床意义。

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