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【摘要】 目的 探讨P53、P16、TGFα、EGFR、VEGF在膀胱移行细胞癌组织中的表达及意义。方法 采用免疫组化法,对膀胱移行细胞癌P53、P16、TGFα、EGFR、VEGF表达、缺失及生物学意义进行了研究。结果 60例膀胱移行细胞癌患者中有68.3%(41/60)TGFα阳性表达，EGFR阳性表达率35%(21/60)，VEGF阳性表达率50%(30/60)，P53阳性表达率38.3%(23/60)，P16阳性表达率30%(18/60)。结论 P16阳性表达率与患者的性别无明显相关性、随肿瘤分级和分期增高而降低，而P53、P16、TGFα、EGFR、VEGF的表达率随肿瘤分级、分期的升高而明显增高，并且多个基因的共同表达也随着肿瘤分级、分期的升高而明显增高。
【关键词】 P53 P16 转化生长因子(TGF)α 表皮生长因子(EGFR) 血管内皮生长因子(VEGF) 膀胱肿瘤 免疫组织化学
The expression and significance of P53, P16, TGFα, EGFR and VEGF in bladder transitional cell carcinoma
Guo Xuetao, Cui Mingyu
(Department of Urology, the Central Hospital of Baotou City of Inner Mongolia, Baotou 014040;Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia Medical College, Huhhot 010059, China)
ABSTRACT: Objective To explore the expression and significance of P53, P16, transforming growth factor a (TGFα), epidermal growth factor (EGFR) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in bladder transitional cell carcinoma (BTCC). Methods Immunohistochemistry method was used to study the expression, deletion and significance of P53, P16, TGFα, EGFR and VEGF. Results The positive expression rates of P53, P16, TGFα, EGFR and VEGF in 60 cases of BTCC were 38.3%(23/60), 30%(18/60), 68.3%(41/60), 35%(21/60) and 50%(30/60) respectively. Conclusion There was no significant association between the positive expression of P16 and gender, the pathologic grades and clinical stages (P>0.05). With the tumor pathologic grades and clinical stages increasing, the positive expression rates of P53, P16, TGFα, EGFR and VEGF were also significantly higher, and their common expressions were increased.
KEY WORDS: P53; P16; transforming growth factorα (TGFα); epidermal growth factor (EGFR); vascular endothelial growth factor (VEGF); bladder neoplasms; immunohistochemistry
肿瘤细胞由正常的细胞发生基因突变而产生，致癌过程中需要一种以上的基因突变，突变的基因可能存在相关性。从分子生物学角度探讨肿瘤的发生、发展机制已成为国内外研究的热点，揭示各基因与肿瘤生物学行为的关系及相关性将对肿瘤的研究起到重要作用，为肿瘤的监测、治疗、愈后提供可靠的依据。本研究对P53、P16、转化生长因子(transforming growth factorα, TGFα)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)与膀胱移行细胞癌生物学特征的关系及相关性进行了探讨，以期揭示多基因在肿瘤发生发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 标本及实验材料
1.1.1 标本 来自2002-2004年间在我院及内蒙古医学院附属医院泌尿外科行手术治疗的60例膀胱移行细胞癌患者，每次手术切除标本均进行病理学诊断。所有标本均由2位独立的病理学医生分别诊断，若意见不同，则由第三位医生诊断，并得出结论，诊断标准参照WHO标准分为G1、G2和G3；临床分期由泌尿外科临床医生参照TNM标准完成，分为Tis、T1、T2、T3和T4五类。另取10例正常膀胱黏膜标本作为对照。患者年龄29-76岁，平均48.8岁；其中男性45例,女性15例。60例患者的TNM分期：Tis 8例、T1 25例、T2 11例、T3 11例、T4 5例。WHO分级：G1 16例、G2 18例、G3 26例。
1.1.2 实验材料 P16鼠抗人单克隆抗体，P53鼠抗人单克隆抗体，EGFR兔抗人单克隆抗体，VEGF鼠抗人单克隆抗体均为福州迈新公司产品；TGFα兔抗人单克隆抗体为武汉博士德公司产品；即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒亦购自福州迈新公司。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化染色 同一标本相邻6张石蜡切片(厚度4μm)，分别行5种抗体的免疫组化染色，1张行HE染色复查诊断。
1.2.2 结果判定 以细胞核/浆呈清晰棕黄色或紫色染色为阳性。根据阳性细胞比例分为以下四级：(-)无明显阳性细胞，(+)阳性细胞数<25%，()阳性细胞数26%-50%，()阳性细胞数>51%。选择典型部位，随意取5个高倍视野，计数100个细胞，以平均数作为最后判定。其中(-)定义为该标本目标分子阴性表达，而后三者均为目标分子阳性表达。
1.3 统计学分析 所有数据均以SPSS11.0统计软件分析，其中两组间率比较用χ2检验，多组间比较使用方差分析。
2 结果
2.1 各目标分子的免疫组化染色 EGFR免疫阳性反应颗粒呈红紫色(图1)，VEGF呈显著的棕黄色(图2)，存在于膀胱癌细胞胞浆/胞膜，而在正常膀胱上皮细胞中不表达。这些因子的阳性表达率与患者的性别无关，其阳性表达率随肿瘤级别增高而明显升高(表1)。
P53(突变型)在1例(3/10，30%)正常膀胱上皮及部分膀胱癌中呈阳性表达，阳性反应位于胞核，呈显著的棕黄色或棕色(图3)。P53的阳性表达率与患者的性别无关，其阳性表达率随肿瘤级别增高而明显升高(表1)。
P16在3例(3/10，30%)正常膀胱上皮和部分膀胱癌组织中呈阳性表达，其阳性反应位于细胞核/浆，强阳性呈明显的棕黄色(图4)。P16的表达率或缺失表达率与患者的性别、肿瘤分级、分期无明显相关性(表1)。
TGFα在2例(2/10，20%)正常膀胱上皮及部分膀胱癌中呈阳性表达，阳性反应位于胞浆，呈显著的棕黄色或棕色(图5)。TGFα的阳性表达率与患者的性别无关，其阳性表达率随肿瘤级别增高而明显升高(表1)。
2.2 不同分子的共表达与肿瘤临床病理学特征的相关性 对于同一标本，5种分子的表达情况可分为以下6种：①无任一分子表达；②仅有一种分子表达；③任意2种分子表达；④任意3种分子表达；④任意4种分子表达；⑥5种分子同时表达。按上述标准统计60例标本，并结合患者临床病理学特征行统计学分析(表2)。我们可以看出，2个或2个以下分子共同表达，主要表现在TisT1期和G1；而2个以上分子共同表达主要表现在T2-T4期和G2-G3。由此我们可以得出，随着肿瘤分期分级的升高，多个基因的共同表达也随着升高。
图1 EGFR在侵袭性移行细胞癌(T2G3)中高表达 (×200)（略）
图2 VEGF在侵袭性移行细胞癌(T2G2)中高表达 (×200)（略）
图3 P53在侵袭性移行细胞癌(T4G3)中高表达 (×100)（略）
图4 缺失P16阳性表达（略）
图5 TGFα在侵袭性移行细胞癌(T3G3)中高表达 (×100)（略）
表1 5种分子表达和患者临床病理学特征相关性（略）
PP：阳性率(positive percentage)
表2 不同分子的共同表达与肿瘤临床病理学特征的相关性（略）
3 讨论
3.1 膀胱癌原癌基因的激活或变异 TGFα是正常移行上皮自分泌、旁分泌的生长调节因子，它在膀胱癌发生过程中究竟是抑癌因子还是促癌因子，目前尚未定论。本组实验结果显示膀胱癌TGFα高表达，随病理分级和分期的提高，TGFα表达呈升高趋势。EGFR是TGFα作用的靶蛋白，EGFR在TGFα作用下，细胞恶性增殖的信号向细胞内传导开始[1]。此外，EGFR基础研究表明：2个EGFR的磷酸化位点剪切后，可使正常的红细胞向幼稚红细胞转化，更多的EGFR磷酸化位点被剪切后形成血癌。故我们认为TGFα和EGFR的高表达与致癌基因作用有关，是癌瘤发生的早期信号。目前已有许多实验表明，EGFR不但参与正常细胞的转化，而且与膀胱癌的恶性表型相关，我们的实验结果也支持这种观点。
3.2 抗癌基因的变异或丢失 在十几种抗癌基因的研究中，比较明确与膀胱癌相关的抗癌基因有p16、p53、Rb及nm23基因。本组免疫组化实验表明60例膀胱移行细胞癌中P16的阳性表达率随肿瘤分级、分期的增高而呈降低趋势，P53阳性表达率为38.3%(23/60)，与国外文献报告的P53膀胱移行细胞癌表达率29%-54%相似。
癌基因的激活和抗癌基因的失活或变异是同时发生还是顺序发生，目前尚不清楚，从以往的研究结果看，p53基因突变及p16基因丢失,是膀胱癌的晚期事件。Olumi等[2]通过PCRRFLP发现60%浸润性膀胱癌有17号染色体短臂(17p)丢失，低级和高分级膀胱癌都有9号染色体(9q21-22为p16和p15的基因位点，9q1234为其他抗癌基因的基因位点)丢失，而浸润性膀胱癌发现仅有17号染色体短臂基因(p53基因)突变，因此提出9号染色体的丢失是膀胱癌发生发展的早期事件，而p53突变是膀胱癌晚期事件。由此推断9号染色体主要引发癌细胞增殖，而p53则主要是与细胞恶性表型相关，因而认为p53突变的结果在临床上大约80%的患者发展为浸润性膀胱癌[3]。
3.3 VEGF与膀胱癌复发 肿瘤血管发生在肿瘤的生长、浸润和转移中,起着重要作用。VEGF能特异地刺激血管内皮细胞增殖,促进血管内物质外渗，为肿瘤细胞迁移提供基质,在肿瘤发生发展过程中起重要作用[4]。本组实验表明VEGF 阳性表达率30%(30/60),随膀胱肿瘤病理分级逐步从浅表性向浸润性进展。Obrien等[5]证实VEGF可作为评价膀胱肿瘤恶性分化程度和进行预后判断的良好指标。一方面，浅表性膀胱癌表达高水平VEGF，肿瘤脱落细胞可在膀胱腔内广泛种植，促进克隆增殖,刺激新生血管形成，导致肿瘤反复复发，迅速转移；另一方面，肿瘤周围膀胱组织VEGF表达比正常膀胱组织高，提示肿瘤周围组织微环境发生了异常变化，“血管形成开关”已经被开启[6] 。
综上所述，膀胱癌在形成过程中，是多基因顺序作用的结果，原癌基因的激活和作用常常是协同促癌的。膀胱癌原癌基因、抗癌基因和转化生长因子、血管内皮生长因子，从某一个侧面反映了在膀胱癌形成和复发过程中，可能有TGFα，EGFR，VEGF的过度表达，有ras，myc多种癌基因的变异或激活，有Rb、p53、p16抗癌基因的突变或丢失。由于各种致癌因素的不同，作用环节不同，诱发不同的基因变异。所以，膀胱癌生物习性也不同。
本组实验证明：P16、P53、TGFα、EGFR、VEGF的表达与患者的性别无统计学意义；不同WHO分级及TNM分期BTCC标本，P16蛋白的表达无统计学差异；而P53、TGFα、EGFR、VEGF四种分子的表达有显著差异，且表达随肿瘤分级和分期的升高而增高，可作为判断肿瘤病理分级及临床分期的指标。对于不同肿瘤分级和分期，随着级别增高，阳性分子的数目有明显增加的趋势，提示多分子表达对于预测肿瘤分级和分期较单分子更有意义。
【参考文献】
[1]郭德荣,顾方六,蔡碧娟,等. 高复发及浸润性膀胱癌的分子生物学基础 [J]. 中华泌尿外科杂志, 1999, 20(9):539.
[2]Olumi AF, Tsai YC, Nichols PW, et al. Allelic loss of chromosome 17p distinguishes high grade from lowgrade transitional cell cancinomas of the bladder [J]. Cancer Res, 1990, 50(21):7081.
[3]Anderson CK. Current topics in the pathology of bladder cancer [J]. Proc R Soc Med, 1973, 66(3):283286.
[4]OBrien T, Cranston D, Fuggle S, et al. Two mechanisms of basic fibroblast growth factor induced angiogenesis in bladder cancer [J]. Cancer Res, 1997, 57(1):136140.
[5]阎洪涛,龚百生, 廖勇,等. 膀胱移行细胞癌组织中P53和血管内皮生长因子表达的关系及临床意义 [J]. 中华泌尿外科杂志, 2006, 27(3):178.
[6]叶雄俊,张志文,郭应禄. 血管内皮生长因子在膀胱癌预后判断和监测复发中的意义 [J]. 中华泌尿外科杂志, 2002, 23(7):443.
(编辑 刘 华)
作者单位：内蒙古自治区包头市中心医院泌尿外科，内蒙古包头 014040；内蒙古医学院组织胚胎学教研室，内蒙古呼和浩特 010059