选择性COX2抑制剂NS398对前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响

【摘要】  目的 观察环氧化酶2(COX2)抑制剂NS398对前列腺癌细胞PC3增殖和凋亡的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测不同浓度和不同时间NS398对PC3细胞增殖的影响；RTPCR法检测不同浓度NS398作用PC3细胞24h后COX2 mRNA的表达；酶联免疫测定法(ELISA)检测不同浓度NS398作用PC3细胞24h后PGE2释放水平；流式细胞仪检测不同浓度NS398作用PC3细胞24h后细胞凋亡情况。结果 NS398可以抑制PC3细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性；RTPCR和ELISA法检测结果显示，随着NS398浓度增高，PC3细胞COX2 mRNA表达和PGE2释放水平呈下调趋势；细胞凋亡检测结果显示100、200μmol/L NS398对PC3细胞具有诱导凋亡的作用。结论 NS398可能通过COX2依赖性途径抑制前列腺癌PC3细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

【关键词】  前列腺癌；环氧化酶抑制剂；增殖；凋亡

    Effect of selective cyclooxygenase2 inhibitor NS398 on the proliferation and apoptosis of prostate cancer cell line PC3 in vitro

    Wang Gongcheng, Pu Jinxian, Ding Xiang

    (Department of Urology, The First Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215006, China)ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of cyclooxygenase2 inhibitor NS398 on the proliferation and apoptosis of prostate cancer cell line PC3 in vitro. Methods  The proliferative inhibition of PC3 cells was observed by methyl thiazol tetrazolium(MTT)rapid photocolorimetric assay; the expression of COX2 mRNA in cultured PC3 cells was examined by RTPCR; the release levels of PGE2 was measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA); PC3 cells cultured in different concentrations of NS398 medium for 24h was marked with Annexin VFITC and PI for the cell apoptosis assay by flow cytometry. Results  After the PC3 cells were treated with different concentrations of NS398, the inhibitory rate on proliferation increased with the increasing of concentration and days. The expression of COX2 mRNA and the release levels of PGE2 were decreased compared with those of the control group. PC3 cells cultured in 100 and 200μmol/L NS398 medium for 24h had significantly higher incidence of apoptosis. Conclusion  NS398 can inhibit proliferation of human prostate cancer cell line PC3 and induce its apoptosis in vitro, which may contributed to the COX2 dependent pathway.

    KEY WORDS: prostate cancer; cyclooxygenase inhibitor; proliferation; apoptosis
   
　  环氧化酶2(COX2)是近年来国内外研究的热点，其在包括前列腺癌等多种恶性肿瘤中呈阳性表达[1]，因而选择性阻断或抑制COX2的活性，可能有利于前列腺癌的预防和治疗。我们利用选择性COX2抑制剂氮2，环己氧4，硝基苯甲基磺胺(NS398)干预前列腺癌PC3细胞，观察其对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其可能存在的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料  人前列腺癌细胞株PC3细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)；NS398(美国Sigma公司)；5%四甲基偶氮唑蓝(MTT溶液，美国Sigma公司)；胰蛋白酶、RMPI1640培养基、小牛血清(美国Gibco公司)；PGE2酶联免疫测定试剂(苏州大学医学院血栓研究所)。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  PC3细胞在10%灭活小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，细胞增殖覆盖培养瓶底面积90%时，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞传代或用于实验。

    1.2.2  NS398对PC3细胞增殖影响的检测  制备PC3单细胞悬液，PC3细胞以5×103个/孔接种于96孔培养板中，24h后换含有不同NS398浓度梯度(0、10、50、100、200μmol/L)的含10%血清RPMI1640培养液，分别在加药后24、48、72、96h行MTT快速比色，酶联免疫检测仪读取每孔的吸光度值(λ=570nm)，按下列公式计算，细胞增殖抑制率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

    1.2.3  PC3细胞COX2 mRNA表达的检测  PC3细胞以5×105个/孔接种于6孔培养板，24h后各取6孔换含有10、100、200μmol/L NS398无血清RPMI1640培养液作为实验组，6孔换含有0.5%二甲基亚砜(DMSO)无血清RPMI1640培养液作为对照组，培养24h后消化、收集细胞。1×106 PC3细胞，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定纯度，调整RNA浓度至0.5μg/μL待用。逆转录合成cDNA，PCR体系中COX2引物序列：5′TGCTGAAGCCCTATGAAT3′，5′CAGAAGGGCAGGATACAG3′产物114bp；内参βactin引物序列：5′GATGACAAGAAGGTGGTGAAG3′，5′GTCTTACTCCTTGGAGGCCATGT3′，产物246bp。PCR产物在2%琼脂糖上电泳，凝胶图像分析仪扫描记录结果。

    1.2.4  PC3细胞释放PGE2测定  PC3细胞以1×105个/孔的密度接种于24孔板，24h后换无血清RPMI1640培养液，设0.5% DMSO对照组及10、100、200μmol/L NS398实验组，每组设6个复孔，培养24h后收集上清，存于-20℃中备用。取上述细胞培养上清，按PGE2酶联免疫试剂盒说明测定PGE2。

    1.2.5  细胞凋亡检测  PC3细胞以5×105个/孔接种于6孔培养板，24h后各取6孔换含有10、100、200μmol/L NS398无血清RPMI1640培养液作为实验组，6孔换含有0.5% DMSO无血清RPMI1640培养液作为对照组，24h后消化、收集细胞。根据Annexin VFITC凋亡检测试剂盒的操作流程，标记Annexin VFITC和PI，流式细胞仪检测。检测结果的判定：正常细胞Annexin V(-)、PI(-)，早期凋亡Annexin V(+)、PI(-)，晚期凋亡Annexin V(+)、PI(+)，死亡细胞Annexin V(-)、PI(+)。

    1.3  统计学方法  采用SPSS11.5统计软件处理数据，进行t检验、ANOVA分析。

    2  结    果

    2.1  不同浓度NS398和不同作用时间对PC3细胞增殖的影响  不同浓度NS398处理PC3细胞24、48、72和96h后，通过MTT法分析，发现NS398对PC3细胞的生长有明显的抑制作用。NS398浓度为10μmol/L时，对PC3细胞生长几乎无抑制作用，但随着作用时间和药物浓度的升高，对PC3细胞生长抑制作用明显增强，呈时间剂量依赖性(表1)。表1  不同浓度NS398作用下的PC3细胞增殖抑制率

    2.2  PC3细胞COX2 mRNA表达  不同浓度NS398作用PC3细胞24h后，与对照组相比，100、200μmol/L NS398实验组COX2 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，随着NS398浓度的增加，COX2 mRNA表达呈逐渐下调趋势，且实验组间差异有统计学意义(P<0.05)。而10μmol/L组与对照组相比，差异无统计学意义(图1，表2)。

    2.3  NS398对PC3细胞释放PGE2活性的影响  NS398可明显抑制PC3细胞PGE2释放，0、10、100、200μmol/L NS398作用后，ELISA法测定PGE2值分别为129.24±6.25，104.68±5.35，74.35±6.64和31.25±2.67，实验组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，随着药物浓度的增加，PGE2释放水平逐渐下降，实验组间差异有统计学意义(P<0.05)。

    2.4  细胞凋亡检测  10、100、200μmol/L NS398作用PC3细胞24h后，PC3细胞凋亡比例升高，细胞凋亡率分别为(1.02±0.05)%、(26.51±1.08)%、(44.33±1.85)%，与对照组凋亡率(0.89±0.06)%相比，100、200μmol/L NS398实验组凋亡比例增高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着药物浓度的增加，PC3细胞凋亡比例呈增高趋势，实验组间差异有统计学意义(P<0.05)。10μmol/LNS398实验组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，图2)。图2  不同浓度NS398作用PC3细胞后细胞凋亡检测结果

  3  讨    论

    环氧化酶(COX)是催化前列腺素生物合成的限速酶，存在两种同分异构体形式，即COX1和COX2。COX1在大多数细胞内为构成性表达，发挥看家基因功能，而COX2是一种诱导性酶，受细胞因子、生长因子、癌基因及肿瘤促进剂的刺激，COX2表达上调，使其产生对各种炎症做出反应的前列腺素类物质(PGs)。Lee等[2]发现与良性前列腺组织相比，前列腺癌细胞COX2呈过表达，而COX1表达没有明显差异。在我们相关的研究中也提示，前列腺癌组织中COX2异常表达，且与前列腺癌生物学行为密切相关[3]。

    文献报道[45]，COX2抑制剂有防治肿瘤的作用，但目前对COX2抑制剂防治肿瘤的具体机制并不完全清楚，一般认为COX2抑制剂主要是通过干预花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的代谢而防治肿瘤。AA代谢有三条途径，分别为COX代谢途径，脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)代谢途径和P450代谢途径。经典的理论认为COX2抑制剂通过抑制COX代谢途径中的诱导酶COX2而发挥抑制肿瘤增殖和诱导肿瘤凋亡作用，即所谓的“COX2依赖性作用”。AA经COX2催化后的下游产物前列腺素E2(PGE2)可以促进肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤血管的生成，提高抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平以及降低自然杀伤细胞的活性从而逃避免疫监视[6]。而近期研究资料亦显示COX2非依赖性途径抗癌机制的存在，Han等[7]发现COX2选择性抑制剂Celecoxib通过转录后调节增加p21waf1/cip1 和p27Kip1的表达是其抑制癌细胞增殖的一种新机制。

    本实验研究从AA代谢的COX2途径出发，观察COX2选择性抑制剂NS398对前列腺癌PC3细胞增殖的影响，并初步探讨其可能存在的机制。MTT法结果显示，NS398可较好的抑制前列腺癌PC3细胞的增殖，在一定范围内呈时间和剂量依赖性，RTPCR和ELISA检测结果显示随着NS398浓度增高，PC3细胞的COX2 mRNA表达和PGE2释放水平呈下调趋势。同时，细胞凋亡检测显示100，200μmol/L NS398对PC3细胞具有诱导凋亡的作用。由此，我们可推测NS398在抑制PC3细胞增殖过程中可能通过依赖COX2途径，即通过抑制COX2的表达，减少了刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡的PGE2生成，从而达到防治前列腺癌的作用。

    虽然COX2抑制剂在防治肿瘤中功能角色尚不完全清楚，但其抑制肿瘤生长的效果是肯定的。Pruthi等[8]在最近研究中发现，在行前列腺癌根治术及放射治疗后的患者中，规律服用Celecoxib的患者前列腺特异性抗原(PSA)水平明显低于未服用者，前列腺癌的危险性明显降低。本研究结果证实，COX2选择性抑制剂NS398可能通过COX2依赖性途径抑制前列腺癌PC3细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。这提示COX2很可能成为前列腺癌化学预防和治疗的有效靶点，COX2选择性抑制剂有望成为前列腺癌化学预防和治疗的有效药物。

【参考文献】
  [1]Gupta S, Srivastava M, Ahmad N, et al. Overexpression of cyclooxygenase2 in human prostate adenocarcinoma [J]. Prostate, 2000, 42(1):7378.

[2]Lee LM, Pan CC, Cheng CJ, et al. Expression of cyclooxygenase2 in prostate adenocarcinoma and benign prostatic hyperplasia [J]. Anticancer Res, 2001, 21(2B):12911294.

[3]丁翔，严春寅，温端改，等. COX2、bcl2和PCNA在前列腺癌中的表达及其意义 [J]. 苏州大学学报(医学版), 2005, 25(1):110112.

[4]Courtney ED, Melville DM, Leicester RJ. Review article:chemoprevention of colorectal cancer [J]. Aliment Pharmacol Ther, 2004, 19(1):124.

[5]Tajamul H, Sanjay G, Hasan M. Cyclooxygenase2 and prostate carcinogenesis [J]. Cancer Letters, 2003,191(2):125135.

[6]Kirschenbaum A, Liu X, Yao S, et al. The role of cyclooxygenase2 in prostate cancer [J]. Urology, 2001, 58(2A):127131.

[7]Han C, Leng J, Demetris AJ, et al. Cyclooxygenase2 promotes human cholangiocarcinoma growth:evidence for cyclooxygenase2independent mechanism in celecoxibmediated induction of p21waf1/ cip1 and p27 kip1 and cell cycle arrest [J]. Cancer Res, 2004, 64(4):13691376.

[8]Pruthi RS, Derksen ED, Moore D. A pilot study of use of the cyclooxygenase2 inhibitor celecoxib in recurrent prostate cancer after definitive radiation therapy or radical prostatectomy [J]. Br J Urol, 2004, 93(3):275278.

作者单位：(苏州大学附属第一医院泌尿外科，江苏苏州 215006)