Ecadherin和CAR在人膀胱癌细胞中的表达及其意义

【摘要】  目的 检测上皮型钙黏素(Ecadherin)和柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor, CAR)在多种人膀胱癌细胞中的表达情况，初步讨论Ecadherin与CAR在人膀胱癌细胞中表达的意义及两者间的关联。方法 用Western印迹法测定人膀胱癌细胞中Ecadherin和CAR的表达情况。结果 Ecadherin、CAR在RT4、5637细胞中表达较高，在253J细胞中表达较低；Ecadherin在J82、T24细胞中不表达，CAR在J82细胞中微弱表达，在T24中不表达。结论 Ecadherin和CAR在人膀胱癌细胞中的表达趋势一致，两者可能相互协作，共同参与膀胱癌的侵袭转移过程。

【关键词】  膀胱癌；上皮型钙黏素；柯萨奇腺病毒受体；侵袭转移

      膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，在国内其发病率居泌尿系统恶性肿瘤第一位，多为移行上皮来源，具有多发和容易复发的特点。肿瘤细胞间黏附性下降是肿瘤侵袭转移的重要环节。本研究检测了上皮型钙黏素(Ecadherin)和柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor, CAR)两种细胞黏附分子在多种人膀胱移行癌细胞中的表达，探讨Ecadherin和CAR与膀胱癌侵袭转移的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  人膀胱癌细胞株RT4、5637、253J、T24和J82，由美国Emory大学Leland WK Chung教授馈赠。

    1.1.2  主要抗体  兔抗人Ecadherin多克隆抗体(Santa Cruz公司)由美国Emory大学Leland WK Chung教授馈赠，兔抗人CAR多克隆抗体(Santa Cruz公司)，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自上海KangChen BioTech公司，辣根酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗均购自北京中山生物技术有限公司。

    1.1.3  显色试剂  ECL显色试剂购自美国Amersham Bioscience公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  所有细胞株用含100g/L胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培养液(美国Gibco公司)在37℃、5%(体积分数)CO2的培养箱内培养。

    1.2.2  蛋白提取  生长状态良好的细胞其数目达到培养皿(培养瓶)底面积80%-90%后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，加入RIPA裂解液，将细胞充分裂解，用细胞刮刮下裂解物并转移至1.5mL Eppendrof管中，用旋涡混匀器充分混匀，冰上静置10min，然后在4℃条件下，15000r/min离心15min，提取上清总蛋白。留取10μL上清液用标准的Bradford法定量。其余上清加入上样缓冲液(loading buffer)后在沸水中煮沸5min变性。

    1.2.3  Western印迹  按每孔20μg上样，100g/L聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳分离，再用30V电压将凝胶上的蛋白转至硝酸纤维素膜(NC膜)上。50g/L脱脂奶粉将膜封闭1h后，加入一抗(兔抗人Ecadherin，稀释度为1∶500；兔抗人CAR，稀释度为1∶300；小鼠抗人GAPDH，稀释度为1∶10000)，常温孵育1.5h，洗涤液(TBST)充分漂洗后加入辣根酶标记的二抗(羊抗兔IgG，稀释度为1∶3000；羊抗小鼠IgG，稀释度为1∶3000)孵育1h。最后用ECL显色试剂显色。应用Glyko Bandscan对显色条带进行灰度分析。

    2  结    果

    Ecadherin和CAR在RT4、5637、253J细胞中均表达，其中在RT4细胞中表达均最高，在5637细胞中表达次之，253J细胞中表达均最低。Ecadherin在J82、T24细胞中均不表达，CAR在J82中表达很低，在T24中不表达(图1、2)。

    3  讨    论

    本研究中，人膀胱癌细胞株RT4、5637、235J、J82、T24均来源于移行上皮，但其分化程度、细胞形态却有很大差异。RT4、5637细胞分化良好，其中RT4细胞具有较典型的上皮细胞形态。253J分化中等，具有部分间变性质。J82、T24细胞分化较差，恶性度高[12]。而肿瘤细胞间黏附与细胞本身生物性特性直接相关。本研究通过检测上述膀胱癌细胞株表面重要的黏附分子Ecadherin和CAR，探讨两者的表达情况与肿瘤细胞恶性程度的关系，揭示两者在膀胱癌侵袭转移过程中的作用。

    钙黏附蛋白是一组介导同一种细胞互相黏附的钙依赖性的跨膜糖蛋白。包括上皮组织中的E钙黏素(Ecadherin)，肌肉和成人神经组织中的N钙黏素(Ncadherin)，胎盘组织中的P钙黏素(Pcadherin)等亚族成员[3]。其中Ecadherin是研究得最多、与肿瘤转移关系最密切的钙黏蛋白，其相对分子质量为120ku，正常情况下表达于上皮源细胞膜表面，介导同型细胞间黏附。当其表达下降时，细胞间的黏附作用减弱，细胞容易脱落。已有许多研究表明上皮肿瘤的发生、发展与Ecadherin的表达、缺失程度关系密切，并与肿瘤预后相关[ 45]。Shino等[6]报道在胃癌非肿瘤区Ecadherin表达正常，在未分化癌，硬癌及远处转移癌中表达下降。Ross等[7]报道膀胱癌Ⅰ级Ecadherin保留表达66%，Ⅱ、Ⅲ级分别为45%、33%，提示Ecadherin降低表达与肿瘤高分期和进展有关，表浅型膀胱癌与浸润型膀胱癌相比，后者Ecadherin表达明显减弱。有研究表明，Ecadherin降低表达与膀胱癌组织学分级、分期呈负相关性[8]。本研究中，Ecadherin在RT4、5637、235J、J82、T24细胞中的表达依次降低，这些肿瘤细胞的上皮特性逐渐减弱，细胞间黏附性逐渐下降，逐渐变得更具有侵袭性，细胞恶性度逐渐增加，证实了Ecadherin的表达与膀胱癌细胞的恶性度之间呈负相关性，与其侵袭能力密切相关。

    CAR最早是作为腺病毒受体而被人们发现和认识，它是分子质量为46ku的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，能够介导腺病毒与靶细胞结合，在以腺病毒为载体的基因治疗领域起着重要的作用。近年来的研究表明，CAR是一种细胞间黏附分子[9]。恶性上皮细胞肿瘤的侵袭、转移与CAR的表达缺失及功能障碍有关[10]。Okegawa等[11]用半定量RTPCR方法检测了不同分期、分级的新鲜或液氮冻存膀胱癌组织及癌旁组织中CAR mRNA的差异，结果显示，所有正常组织都可检测到CAR mRNA的表达，pTl期和pT2期的表达水平无显著差异；基于检测的膀胱癌标本病理学特征的不同，用同一病例的肿瘤组织与癌旁组织中CAR mRNA表达的比值，即“T/N值”，来评价不同分期间CAR mRNA的差异，发现pT3，pT4的“T/N值”明显低于pTl，表达差异显著。因此，认为CAR的表达与膀胱癌分期、分级呈负相关。Scachs[10]用兔抗人CAR多克隆抗体CAR72，对甲醛固定、石蜡包埋的不同分级、分期的膀胱癌及正常膀胱组织进行CAR表达的免疫组织化学检测，首次证实：随着膀胱癌临床分级的恶性进展，CAR的蛋白表达及基因表达均下调。他们认为，这种“下调”现象将对发展腺病毒介导的基因治疗策略产生巨大影响。CAR的表达缺失与膀胱癌的侵袭能力密切相关。本研究中，CAR在RT4、5637、235J、J82、T24细胞中的表达也依次降低, 而肿瘤细胞的恶性度却逐渐增加，证实了CAR的表达与膀胱癌细胞的恶性度之间也呈负相关性，与其侵袭能力也密切相关。

    本研究表明，Ecadherin和CAR在人膀胱癌细胞RT4、5637、235J、J82、T24中的表达均呈现依次降低的趋势，与膀胱癌细胞的恶性度之间呈负相关性，并与其侵袭能力密切相关。作为细胞间黏附分子，Ecadherin和CAR在限制膀胱癌侵袭转移过程中可能存在协同作用，但两者是否存在信号通路交联、各自作用的大小以及其他肿瘤细胞中是否也表达一致，有待进一步的深入研究。

【参考文献】
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[3]Arenas MI, Romo E, Royuela M, et al. E, N and Pcadherin, and alpha, beta and gammacatenin protein expression in normal, hyperplastic and carcinomatous human prostate [J]. Histochem J, 2000, 32(11):659667.

[4]Kashibuchi K, Tomita K, Schalken JA, et al. The prognostic value of Ecadherin, alpha, beta, and gammacatenin in urothelial cancer of the upper urinary tract [J]. Eur Urol, 2006, 49(5):839845.

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[9]Cohen CJ, Hsieh JT, Pickles RJ, et al. The coxsackievirus and adenovirus receptor is a transmembrane component of tight junction [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(26):1519115196.

[10]Scachs MD, Rauen KA, Ramamurthy M, et al. Integrin alpha (v) and coxsackieadenovirus receptor expression in clinical bladder cancer [J]. Urology, 2002, 60(3):531536.

[11]Okegawa T, Pong RC, Li Y, et al. The mechanism of the growthinhibitory effect of coxsackie and adenovirus receptor(CAR) on human bladder cancer: a functional analysis of CAR protein structurel [J]. Cancer Res, 2001, 61(17):65926600.

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061