银杏叶提取物对实验性脊髓损伤后细胞凋亡的影响

    ［摘要］  目的  观察银杏叶提取物（GBE）对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法  选择SD雄性大鼠（SPF级）30只，随机分成对照组和GBE组，均采用改良的Allen打击法制成中度急性脊髓损伤模型，术后GBE组给予GBE 0.75 mL/(kg·d)，对照组给予等量生理盐水。分别于术后1、3、5、7、14 d处死动物取材，采用流式细胞仪检测伤段脊髓细胞凋亡的情况。结果  对照组和GBE组均发现凋亡细胞，均在5 d达到高峰，但GBE组凋亡细胞比率显著低于对照组（t=4.97~9.56，P<0.05）。结论  GBE能够减少神经细胞的凋亡；抗凋亡可能是GBE缓解急性脊髓损伤的诸多机制之一。

　　［关键词］  银杏叶提取物；脊髓损伤；细胞凋亡；大鼠

　　ANTIAPOPTOSIS EFFECT OF GINKGO BILOBA EXTRACT ON RATS WITH EXPERIMENTAL SPINAL CORD INJURY

　　ZHANG ZHONGLI,  LI XIN

　　(Department of Orthopedics,  Peoples Hospital of Weifang,Weifang 261041, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the antiapoptosis effect of Ginkgo biloba extract(GBE) after the spinal cord injury in SD rats.MethodsThirty SD male rats were randomly divided into two groups: control group and GBE group. The spinal cord injuries of the rats were induced by Allens way by a 5 g×5 cm impact on the posterior T9 spinal cord in moderate degree. The rats in the control group were treated with normal saline,  while those in the other group were administrated GBE 0.75 mL/ (kg·d). The rats were sacrificed at 1,  3,  5, 7,  14 d after the injury. The cell apoptosis of the injured spinal cord was examined by flow cytometry. ResultsPositive expression of apoptotic cells appeared in both groups and reached their peak on third day after the injury. The cell apoptosis of the GBE group was significantly lower than that of the control group (t=4.97-9.56，P<0.05).  ConclusionGBE has neuroprotective effects on the experimentally injured spinal cord and can decrease the neuronal apoptosis.

　　［KEY WORDS］Ginkgo biloba extract; spinal cord injury; apoptosis; rats
   
　　脊髓损伤后神经细胞发生凋亡，使原发损伤不断加重［1～4］。中药制剂银杏叶提取物（GBE）已被证实可促进损伤神经元恢复，对中枢神经系统具有保护作用，是治疗脑功能损害的有效药物［5］，但是该药对脊髓损伤的作用国内外尚却少有报道。本文通过流式细胞仪检测研究了GBE对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  脊髓损伤模型的制备与分组
 
　　成年雄性健康SD大鼠(SPF级) 30只，体质量250～300 g，购自武汉大学医学院实验动物中心。40 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒，暴露T8～10椎板和硬脊膜，以5 g×5 cm致伤力采用改良的Allen打击法建立T9脊髓中度急性损伤模型。依次缝合竖脊肌、皮下组织与皮肤。术毕每天每只肌肉注射青霉素10万单位，室温保持在20～25 ℃，每天人工挤压膀胱排尿1～2次，直至恢复自主排尿（约5～7 d）。大鼠术后随机分为两组：GBE（商品名：舒血宁, 北京双鹤药业公司生产）组术后立即给予GBE 0.75 mL/(kg·d)，持续１周；对照组术后给予等量生理盐水。

　　1.2  取材与检测方法

　　将GBE组和对照组大鼠分别于对应的5个时间点断头处死，迅速取出T8～10脊髓节段，置于体积分数为0.70的乙醇溶液固定后，机械破碎，加入1 mL DHank液，振荡器混匀，依次200目、400目筛网过滤，4 ℃ 300 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用冰生理盐水稀释，配成1×109/L的单细胞悬液。取1 mL上述单细胞悬液，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用500 μL 1×buffer溶解，再依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI，室温避光孵育10 min，进行流式细胞检测。

　　2  结果

　　流式细胞检测显示1 d后凋亡开始增加，3～7 d达到高峰，之后凋亡细胞逐渐减少。GBE组5个时间点的凋亡率均明显低于对照组（t=4.97~9.56，P<0.05）。结果见图1。
 
　　图1  两组大鼠脊髓损伤后不同时间点细胞凋亡百分比（略）

　　3  讨论

　　LI等［1］ 最早提出脊髓损伤后存在细胞凋亡的观点。 BARINAGE［2］认为在脊髓继发性损伤中细胞凋亡主要是神经胶质细胞的凋亡，而随后LIU等［3］和 CROWE等［4］通过大鼠和猴的脊髓损伤模型阐明，神经元在脊髓继发性损伤中同样存在凋亡改变。目前已发现继发性脊髓损伤是多种神经生化机制及血管机制相互级联、不断恶化的过程，如脂质过氧化反应、炎症反应、钙离子内流、局部出血、生化条件改变、细胞因子网络紊乱等［6，7］。这些因素在细胞水平上作用的结果，早期以神经细胞坏死为主，而在亚急性期，则以诱导神经细胞凋亡为主。细胞凋亡主要伴随脊髓继发性损伤而出现，脊髓损伤第1天后开始出现细胞凋亡，第3~7天达高峰，以后3周左右逐渐减少，凋亡细胞以神经元细胞和少突胶质细胞为主，并可进一步引起轴索脱髓鞘［8］。

　　GBE早在20世纪70年代的法国和德国开始用于心血管临床，黄华等［5］证实其对大脑硬性挫伤的行为恢复有影响。本实验证实GBE可以显著减少脊髓继发损伤后神经细胞的凋亡，尤其在凋亡发生的高峰第5天，可以显著降低凋亡细胞的百分率，说明其对脊髓神经细胞具有保护作用。

　　ZHU等［9］研究表明，GBE可以降低神经元细胞内钙离子水平，从而减轻了脊髓的继发损伤。发生凋亡的神经细胞，最早可以检测到的生物化学变化是神经细胞内快速、持续的钙离子浓度增高，而抑制神经细胞内钙离子浓度的增高，可以抑制细胞凋亡的发生，说明细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的重要条件。KOBUCHI等［10］用小鼠巨噬细胞线RAW264.7证明GBE可以直接清除脂多糖加γ干扰素诱发的NO产生，并且同时还可抑制一氧化氮合成酶（iNOS）的活性及其mRNA的表达。而有人用NOS免疫组化及NOS mRNA原位杂交方法，显示脊髓损伤后神经细胞内可表达iNOS，并且给予NOS抑制剂硝基精氨酸则可以显著减少神经元细胞死亡的数目。GBE正是通过上述作用机制减少神经细胞的凋亡，从而发挥对脊髓神经细胞的保护作用。作为祖国传统中药，GBE还具有副作用小的优点。本文通过流式细胞仪检测凋亡细胞的方法，证明GBE能够显著减少受伤脊髓神经细胞的凋亡，从而减轻受伤脊髓的继发性损害，这为GBE的临床应用提供了理论基础。

　　［参考文献］

　　［1］LI G L,  BRODIN G,  FAROOQUE M,  et al. Apoptosis and expression of Bcl2 after compression trauma to rat spinal cord［J］. J Neuropathol Exp Neurol,  1996,55(3):281.

　　［2］Barinage M. New view of spinal cord ［J］. Science,  1996, 274:1466.

　　［3］LIU X Z,  XU X M,  HU R,  et al. Neuronal and glial spoptosis after traumatic spinal cord injury［J］. J Neurosci,  1997,17:5395.

　　［4］CROWE M J,  BRESNAHAN J C,  SHUMAN S L,  et al. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys［J］. Nat Med,  1997,3 (1):73.

　　［5］黄华，何海燕，黄亿华，等. 切断海马伞对大鼠硬性脑挫伤后运动行为恢复的影响［J］.动物学报， 2003，49（2）：211.

　　［6］CHARRIANT C,  MARGAILL L,  REPRESS A,  et al. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:an in situ DNA fragmentation analysis［J］. J Cereb Blood Flow Metab,  1996, 16(2): 186.

　　［7］刘世清，王钢，陶海鹰. 丹参对脊髓损伤后血清钙、镁、锌、铜含量的影响［J］. 中国中医骨伤杂志， 2001，9(3):13.

　　［8］LEE Y B,  YUNE T Y,  BAIK S Y,  et al. Role of tumor necrosis factoralpha in neuronal and glial apoptosis after spinal cord injury［J］. Exp Neurol,  2000,166(1):190.

　　［9］ZHU L,  WU J,  LIAO H,  et al. Autagonistic effects of extract from leaves of ginkgo biloba on glutamate neurotoxicity［J］. Zhongguo Yaoli Xuebao,  1997,18:344.

　　［10］KOBOCHI H,  DROYLEFAIX M T,  CHRISTEN Y,  et al. Ginkgo biloba extract(GBE761): inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW264.7［J］. Biochem Pharmacol,  1997,53:897.

　　（本文编辑  马伟平）

　　［基金项目］湖北省科技攻关课题资助项目（2003AA301C12）

　　［作者简介］张忠礼（1977），男，硕士, 主治医师。

　　（潍坊市人民医院创伤外科, 山东 潍坊  261041; 潍坊医学院生理学教研室）