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[摘要] 目的 探讨尼莫地平对实验性癫痫鼠的抗氧化作用。方法 50只Wistar大鼠随机分为5组,各10只。正常对照组:腹腔注射生理盐水;癫痫组:腹腔注射戊四氮(PTZ)50 mg/kg, 诱发癫痫后30 min处死;尼莫地平0.1、0.3、0.5 mg/kg 组:腹腔注射PTZ 50 mg/kg前15 min分别注射尼莫地平注射液0.1、0.3、0.5 mg/kg, 每隔24 h重复1次,连续3 d后处死。观察各组大鼠癫痫样发作的潜伏期、持续时间、发作形式,并测定各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷光甘肽过氧化物酶(GSHPX)活性。结果 尼莫地平预处理各组大鼠癫痫发作类型以轻型发作为主,发作潜伏期明显延长,持续时间短; SOD活性较癫痫组明显增高,MDA、GSHPX活性明显下降,差异均有显著性(F=10.720~35.831,P<0.01)。结论 尼莫地平可通过抗氧化机制来发挥抗癫痫作用。
[关键词] 尼莫地平;癫痫;自由基;动物实验;大鼠,Wistar
ANTIOXIDANT EFFECT OF NIMODIPINE ON RATS WITH EPILEPSY INDUCED BY PENTETRAZOLE
XIE ANMU,TAN LAN, ZHANG CHEN, et al
(Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)
[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the antioxidant role of nimodipine in experimentalepilepsy rats. MethodsFifty Wistar rats were divided into 5 groups: control group, epilepsy group, and 0.1 mg, 0.3 mg, and 0.5 mgnimodipine groups. The incubation period, duration, and the onset of epilepsy were observed and SOD, MDA, and GSHPX of brain tissue were determined in the nimodipine group. The results were compared with those of the PTZ epilepsy group. ResultsThe onset in nimodipinepretreatment group was characterized by light seizure, prolonged incubation time, short duration and high SOD, low MDA and GSHPX. There were significantly difference between them (F=10.720-35.831,P<0.01). ConclusionAntiepileptic role of nimodipine may be achieved by its antioxidation.
[KEY WORDS]nimodipine; epilepsy; free radicals; animal experimentation; rats, Wistar
目前癫痫的发病机制还未完全阐明,但K+、Na+、Ca2+、Mg2+细胞内外浓度的变化是癫痫发作的生化基础,其中Ca2+内流在癫痫发作中起重要作用。Ca2+拮抗剂有拮抗癫痫的作用[1]。尼莫地平是选择性的Ca2+拮抗剂,有许多作者利用动物模型观察了它的作用[2~4]。癫痫活动伴有活跃的自由基反应,而自由基有很强的神经毒性。尼莫地平抗癫痫除与抑制Ca2+内流有关外,是否与抑制自由基有关,国内外未见报道。本研究进一步探讨了癫痫的发病机制以及尼莫地平对癫痫的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选择体质量为250~300 g的Wistar大鼠(由山东大学医学院提供)50只,雌雄各半。戊四氮(PTZ),美国Serva公司出品,用前配成40 g/L的生理盐水溶液。尼莫地平注射液, 由山东新华制药厂提供。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷光甘肽过氧化物酶(GSHPX)试剂盒由南京建材生物制品研究所提供。紫外线分光光度计,产地上海,型号753B1。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及处理 将大鼠随机分成5组,各10只。①组:腹腔注射生理盐水作为正常对照组;②组:腹腔注射PTZ 50 mg/kg, 诱发癫痫后30 min处死;③、④、⑤组:腹腔注射PTZ 50 mg/kg前15 min分别注射尼莫地平注射液0.1、0.3、0.5 mg/kg, 每隔24 h重复1次,连续3 d后处死。处死后快速断头,取出脑组织,冷生理盐水冲洗,称取额叶皮质50 g,用冷生理盐水作匀浆介质,匀浆器匀浆,3 000 r/min离心15 min,取上清液备用。
1.2.2 观察指标 观察各组大鼠癫痫样发作的潜伏期、持续时间、发作形式。潜伏期指腹腔注射PTZ后至开始有抽搐反应的时间。持续时间指开始有抽搐反应至停止发作的时间。参照RACINE分级标准对痫性发作行为分级。0级:无反应或抽搐停止;Ⅰ级:节律性嘴和面部抽动;Ⅱ级:点头或甩尾;Ⅲ级:单肢抽动;Ⅳ级:多肢抽动或强直;Ⅴ级:全面性强直阵挛发作。
1.2.3 SOD、MDA及GSHPX活性测定 应用考马斯亮蓝G250染色法 (Bradford法) 测定样本的蛋白质浓度,调整所有样本的蛋白质浓度至0.6 g/L。SOD、MDA、GSHPX活性测定采用化学比色法,按照试剂盒说明书操作。
1.3 统计学处理
结果用±s表示,数据间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 各组大鼠痫性发作的潜伏期、持续时间、发作形式比较
2.1.1 发作形式 ①组:无痫性发作;②组:6例表现为Ⅳ~Ⅴ级,4例为Ⅲ级。③组:2例为Ⅲ级,6例为Ⅰ~Ⅱ级,2例0级。④组:1例Ⅲ级,7例为Ⅰ~Ⅱ级,2例0级。⑤组:5例为Ⅰ~Ⅱ级,4例0级,1例死亡。
2.1.2 潜伏期 ②组:1 min 9例,2 min 1例。③组:2 min 2例,3 min 3例,4 min 2例,5 min 1例,2例未发作。④组:3 min 3例,4 min 1例,5 min 2例,10 min以上2例,2例未发作。⑤组:4 min 1例,6 min 2例,7 min 2例,未发作4例。
2.1.3 持续时间 ②组:9 min 1例,8 min 3例,6 min 1例,4 min 5例。③组:5~6 min 2例,3~4 min 2例,1~2 min 4例。④组:3 min 2例,2 min 2例,1 min 4例。⑤组:4 min 1例,3 min 2例,2 min 2例。
2.2 各组SOD、MDA、GSHPX活性检测结果比较
③、④、⑤组大鼠发作类型以轻型发作为主,发作潜伏期明显延长,持续时间短; SOD活性较②组明显增高,MDA、GSHPX明显下降,差异均有显著性(F=10.720~35.831,P<0.01)。见表1。
表1 各组大鼠脑组织SOD、MDA、GSHPX检测结果(略)
3 讨论
3.1 尼莫地平拮抗癫痫作用机制
已有研究表明,Ca2+过量内流与痫性活动形成有关[1],推测Ca2+拮抗剂具有拮抗癫痫的作用。尼莫地平是L型Ca2+拮抗剂,进入脑内的常量远高于硝苯吡啶,且优先分布于皮质并集中于脑内的各种结构(海马、皮质、丘脑),这些结构是重要的癫痫解剖基础,含有高密度的二氢吡啶结合部位[5],推测尼莫地平在拮抗癫痫方面可能有更好的作用。本文观察了腹腔给予尼莫地平注射液预处理对PTZ致痫大鼠痫样发作的影响,结果表明, 尼莫地平预处理组发作类型以轻型发作为主(Ⅰ~Ⅱ级占50%以上),发作潜伏期明显延长,持续时间短;而未预处理组发作以重型发作为主(Ⅳ~Ⅴ级占60%),发作潜伏期短,发作持续时间长。因此,认为尼莫地平确有抑制癫痫的作用,这与国内外相关文献报道的结果基本一致[2~4]。但也有作者有相反的结果[6],是否与尼莫地平的剂量或者动物模型不同有关,有待于进一步研究。CHAKRABARTI等[7]认为, 尼莫地平在对癫痫的拮抗中具有剂量依赖性。本文3个剂量尼莫地平预处理组均有明显的抗癫痫作用,说明癫痫至少部分是由于Ca2+通道障碍所致;同时也说明还有其他机制参与。
3.2 尼莫地平对癫痫发作时自由基的影响
无论癫痫动物实验模型还是癫痫病人均有活跃的自由基反应,癫痫发作时自由基急速增加。本文结果表明,癫痫模型组与正常对照组相比,SOD活性明显下降,MDA、GSHPX明显上升,与相关文献报道一致[8,9]。提示自由基活跃在癫痫的发展中起重要作用;癫痫时自由基的异常变化可能是癫痫的伴随变化,因为癫痫时Ca2+内流可以激活蛋白激酶,使黄嘌呤脱氢酶迅速转化为黄嘌呤氧化酶,同时产生氧自由基,激活磷脂酶,产生游离脂肪酸及氧自由基。本文观察结果显示,尼莫地平预处理各组SOD活性较模型组明显增高,MDA、GSHPX明显下降,表明自由基清除酶活性有所恢复,自由基减少,提示尼莫地平在抑制自由基的病理损伤中可能起作用,尼莫地平的抗癫痫作用不仅通过抑制Ca2+内流,也通过抑制自由基的进一步病理损害[10]。自由基具有很强的神经毒性,可以使脑细胞脂质产生过氧化损害,导致精神障碍。活性自由基通过减少胶质细胞对谷氨酸的摄入,使其在细胞外蓄积产生兴奋性神经毒性[8]。而兴奋性氨基酸类神经递质(EAAs)在癫痫的发生中起重要作用。EAAs的升高将激活邻近神经细胞膜EAAsR,而激活的N甲基D天门冬氨酸受体可引起大量Ca2+和Na+内流,细胞内Ca2+进一步蓄积,并触发神经末梢EAAs释放,将毒性作用扩散至邻近细胞。细胞内过多的Ca2+可激活DNA蛋白质酶和磷脂酶等,引起DNA蛋白质和磷脂降解,导致恶性循环[11]。
综上所述,尼莫地平对癫痫脑的自由基损害有抑制作用,为尼莫地平在临床上治疗癫痫病人提供了理论依据。
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(本文编辑 黄建乡)
[作者简介]谢安木(1966),男,博士,副主任医师。
(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东 青岛 266003;山东大学附属齐鲁医院神经内科)