海藻提取物抑瘤活性及抗氧化作用的观察

    ［摘要］  目的  探讨松节藻提取物对接种S180肉瘤细胞株小鼠的抑瘤作用以及抗氧化作用。方法  采用Horn法检测松节藻提取物的安全性（LD50）。给予荷瘤鼠喂饲25、50、100 mg/kg松节藻提取物，并设空白及阳性对照组，测定抑瘤率。以体内实验进行提取物的抗氧化活性评价，采用单细胞凝胶电泳法测定淋巴细胞的DNA损伤；以试剂盒测定血浆中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。结果  松节藻提取物的LD50>3 160 mg/kg，属于低毒；松节藻提取物各个剂量组的平均瘤质量明显低于空白对照组，其中50 mg/kg剂量组的抑瘤率达到36.1％；松节藻提取物25 mg/kg剂量组对10 μmol/L的H2O2诱导的DNA氧化损伤有保护作用，且血浆SOD活性增强，MDA含量下降。结论  松节藻提取物为低毒化合物，使用安全；松节藻提取物可有效抑制S180肉瘤的生长；松节藻提取物具有良好的抗氧化作用。

　　［关键词］  松节藻提取物；抑瘤活性；DNA氧化损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛

　　ANTICANCER AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF SEAWEED EXTRACTS

　　DONG CHUNJING，HE JUAN，LIANG HUI， et al

　　(Department of Nutrition,  Qingdao University Medical College,  Qingdao 266021, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the antitumor and antioxidant activities of various dosage of ethanol extract of R. confervoides (EERC) on mice.  MethodsThe half lethal dose (LD50) of EERC was estimated by Horn assay. Sarcoma180 mice were used to evaluate the antitumor activities in vivo of EERC (Cytoxan as positive drug). The antioxidant activities of EERC were detected on mice. The oxidative DNA damage of peripheral lymphocytes induced by H2O2 was analyzed by SCGE. The concentration of superoxide dismutase (SOD), malonyl dialehyde (MDA) in blood plasma were detected with the test kit. ResultsThe EERC showed low toxicity with its LD50 more than 3 160 mg/kg. The tumor inhibition ratios of supplement groups were significantly higher than the blank group. There was a significant decreasing tendency of the oxidative DNA damage on peripheral lymphocytes in the 25 mg/kg supplement group induced by 10 μmol/L H2O2. The level of SOD in the 25 mg/kg supplement group was more than the control group,  while its MDA was less than the control group. ConclusionThe EERC is safe to be taken orally and can obviously inhibit the sarcoma180. The 25 mg/kg EERC can protect the animal from oxidative damage.

　　［KEY WORDS］Rhodomela confervoides; antitumor activity; DNA damage; superoxide dismutase; malondialdehyde
   
　　自20世纪80年代以来，已从海藻中提取了许多具有生物活性的新化合物。松节藻（Rhodomela confervoides）是我国北方沿海常见的一种海藻，属红藻门(Rhodophyta)仙菜目(Ceramiales)松节藻科(Rhodophyceae)。已有研究显示，松节藻醇提物富含溴酚化合物［1］。近年来，人们在对海藻进行抗肿瘤活性筛选过程中发现，松节藻具有较强的选择性细胞毒性［2］。目前对松节藻活性研究大多集中在体外抗菌及抗肿瘤活性筛选方面。本文观察了松节藻提取物对接种S180肉瘤细胞株小鼠肉瘤生长以及DNA氧化损伤的影响。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　松节藻，2003年4月采于山东省青岛市太平角海湾, 由中国科学院海洋研究所提供并鉴定。经各种色谱柱层析和IR、1HNMR、13CNMR、DEPT等波谱解析技术分析表明，松节藻提取物富含溴酚化合物［3］。小鼠S180实体瘤，由中国医学科学院药物研究所引进，山东省医学科学院药物研究所药理室低温冻存保种，复苏后传代5、6、7代。实验动物：纯种昆明小鼠，雌雄各半,体质量为18~23 g。主要试剂：正常熔点琼脂糖（MP）、低熔点琼脂糖（LMP）、RPMI1640购自Gibco BRL公司；荧光剂DAPI购自Boehringer Mannheim公司；小牛血清购自杭州四季青公司；乙二胺四乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠等为国产AR级试剂，均购自青岛爱普生物制剂公司。主要仪器：低温离心机（德国Sigma 3K30型），低温冰箱，电泳仪（北京六一厂），荧光显微镜（日本OLYMPASBH2型）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测试盒由南京建成生物工程所提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  松节藻提取物的制备  取松节藻干品约15 kg，粉碎过筛；体积分数0.95乙醇提取3次，合并得浸膏325 g。用约10倍量的水混悬浸膏，乙酸乙酯萃取；减压蒸干得棕黑色稠膏105 g。

　　1.2.2  松节藻提取物半数致死量（LD50）的测定采用Horn法［4］。20只昆明小鼠，随机分成4组，每组雌性3只，雄性2只，分笼，适应性饲养3 d；第4天给药前禁食16 h，饮水不限，分别以3 160、1 000、316及100 mg/kg松节藻提取物灌胃，观察14 d，记录动物出现症状及死亡情况。

　　1.2.3  松节藻提取物对小鼠S180肉瘤生长的影响制备小鼠S180瘤细胞悬液［5］，台盼蓝染色检查活细胞数，成活率95%以上即可接种。取昆明小鼠50只, 每只于左前肢腋窝皮下接种0.2 mL的S180瘤细胞悬液，整个操作过程30 min内完成。24 h后随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分笼喂养。实验组:灌服松节藻提取物大豆色拉油稀释液，剂量分别为25、50、100 mg/kg（低、中、高剂量组），每日1次，连续10 d。空白对照组：灌服等量大豆色拉油，每日1次。阳性对照组：腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg，每日1次。隔天称体质量，观察小鼠生长情况。末次给药24 h后，处死小鼠，完整剥除肿瘤，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

　　1.2.4  松节藻提取物对DNA损伤的影响  取昆明种小鼠40只，随机分为4组，每组10只，雌雄各半，适应性喂养3 d。实验组:灌服松节藻提取物大豆色拉油稀释液，剂量分别为25、50、100 mg/kg（低、中、高剂量组）,每日1次,连续20 d;空白对照组：灌服等量大豆色拉油,每日1次。末次给药24 h后，眼眶取血置于肝素抗凝的玻璃试管中，混匀。DNA损伤检测采用彗星电泳实验。参照马爱国等［6］的方法,取新鲜抗凝血35 μL加入盛有PRMI1640和体积分数0.10小牛血清的离心管中，0 ℃培养30 min,取淋巴细胞分离液100 μL加到该离心管的底部，离心，取粉红色淋巴细胞层移入磷酸缓冲液中，分别加入5、10、20 μmol/L的H2O2处理5 min，离心，去上清放入冰水浴中备用。取10 g/L熔化了的标准琼脂糖85 μL滴于载玻片上，4 ℃冰箱放置15 min，取10 g/L熔化了的低熔点琼脂糖85 μL和上述淋巴细胞液混匀滴在第一层琼脂薄板上，放入溶解液中处理60 min后，4 ℃电泳30 min，中和液中和，DAPI染色，荧光显微镜下观察。每组观察100个细胞，计算其损伤单位。

　　1.2.5  血浆脂质和抗氧化酶活性的测定  取抗凝血1.5 mL, 3 000 r/min离心10 min，取上层血浆用于脂质及抗氧化酶活性的测定。SOD采用羟胺法测定，MDA采用TBA法测定。

　　2  结果

　　2.1  LD50测定结果

　　饲喂松节藻提取物小鼠经14 d观察未见任何中毒症状，无动物死亡。其LD50>3 160 mg/kg, 属低毒［4］。

　　2.2  松节藻提取物对小鼠S180肉瘤生长的影响

　　松节藻提取物各个剂量组的平均瘤质量明显低于空白对照组，低、中剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义（F=4.08, q=3.12~13.35,P<0.05），其中，中剂量组的抑瘤率达36.1%。见表1。

　　2.3  松节藻提取物对淋巴细胞DNA损伤的影响

　　松节藻提取物各组血淋巴细胞自发及诱发损伤均较空白对照组小，其中在10 μmol/L的H2O2诱发氧化损伤时，低剂量组与空白对照组比较差异有显著意义（F=5.37, q=3.28, P<0.05）。见表2。

　　2.4  松节藻提取物对SOD、MDA含量的影响

　　松节藻提取物各剂量组小鼠血浆中SOD的活性与空白对照组比较均较高，其中低剂量组与空白对照之间的差异具有统计学意义（F=7.71, q=3.93, P<0.05）。松节藻提取物低剂量组小鼠血浆中的MDA含量比中、高剂量及空白对照组低，差异具有显著性（F=6.85,q=4.80~5.33, P<0.05）。见表3。

　　表1  松节藻提取物对小鼠S180肉瘤生长的影响（略）

　　表2  松节藻提取物不同剂量组淋巴细胞DNA损伤（略）

　　表3  松节藻提取物不同剂量组血浆中SOD、MDA含量（略）

　　3  讨论

　　急性毒性实验结果表明, 松节藻提取物LD50>3 160 mg/kg, 是一种低毒物质，使用安全。体内实验结果表明, 松节藻提取物中剂量组的抑瘤率达到36.1％，一般认为抑瘤率超过30％，即可判定该受试物具有抑瘤活性。本实验中松节藻提取物具有较高的抑瘤活性，这可能与松节藻提取物富含酚类化合物有关。酚类化合物从化学预防到直接杀伤肿瘤细胞各环节均能发挥作用。酚类化合物对多种致突变物、致癌物的致突变性及致癌性具有抑制作用，它可阻断前致癌物转变成致癌物, 干预化学致癌物在体内的转化过程；能抑制促癌剂引起的与癌变正相关基因的表达［7］。

　　彗星电泳实验是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等优点，目前已广泛地应用于各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究。本实验结果显示，松节藻提取物各剂量组的血淋巴细胞自发性损伤与空白对照组比较均无显著性差异，说明实验剂量范围内松节藻提取物不会引起小鼠血淋巴细胞的自发性损伤。用5、10和20 μmol/L的H2O2处理以松节藻低剂量组的淋巴细胞DNA损伤较小，其中10 μmol/L的H2O2处理后松节藻低剂量组的淋巴细胞DNA损伤与空白对照组比较有显著性差异, 说明低剂量松节藻提取物具有抗H2O2氧化损伤的能力。其作用机制可能与所含溴酚化合物的结构特点有关，酚类化合物是一类苯环上带有羟基的化合物，其羟基化学性质比较活泼，易于脱氢氧化，是单线态氧、羟自由基、脂质过氧化自由基以及其他自由基有效的淬灭剂和捕捉剂，分子中羟基越多，可提供用于与活性自由基结合的氢原子也越多，抗氧化活性越强。苯环上相邻的两个羟基还可螯合金属离子，减少金属离子活化，抑制某些氧化酶的活性，减少活性氧离子的产生［8］，因此，松节藻提取物可保护机体免受过氧化损伤。

　　SOD是有效清除超氧化物阴离子自由基的一类重要的抗氧化酶，阻止由O2-启动的自由基连锁反应。SOD往往与消除H2O2的酶协同作用，如位于哺乳动物过氧化小体中的过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）。在pH 7.4的条件下，SOD可使O2-转化为H2O2的速度增加约104倍［9］。SOD的活力反映了机体清除氧自由基的能力。本实验显示，低剂量松节藻提取物可有效提高动物体内的抗氧化酶活性，提高机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子产物，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度［9］。本实验表明，补充低剂量松节藻提取物可以增强小鼠的抗氧化能力，使自由基对脂质的氧化作用减弱。提示低剂量松节藻提取物能够有效提高抗氧化酶的活性及降低脂质过氧化物的含量，是松节藻提取物发挥抗氧化作用的最适剂量。

　　综上所述，松节藻提取物有较明显的抑瘤作用及一定的抗氧化能力，并且松节藻在山东半岛有大量分布，因此有很大的开发潜力。

　　［参考文献］

　　［1］PEDERSON M， PEDERSEN M. Bromochlorophenols and a brominated diphenylmethane in red algae［J］. Phytochemistry,  1978，17（2）：291.

　　［2］徐年军，范晓，韩丽君，等. 山东沿海海藻抗肿瘤活性的筛选［J］.海洋与湖沼, 2001，32（4）：409.

　　［3］徐年军, 范晓, 曾呈奎. 海洋红藻松节藻Rhodomela confervoides化学成分研究［J］.中国海洋药物， 2003（2）:1.

　　［4］李寿祺. 卫生毒理学基本原理和方法［M］.成都：四川科学技术出版社, 1987:74,398.

　　［5］KUROSAWA E,  IZAWA M,  YAMAMOTO K, et al. Sesquiterpenes from Dictyopters divaricata.Ⅱ.Dictyoperol and dictyopterone［J］. Bull Chem Soc Jpn, 1966,39:2509.

　　［6］马爱国，COLLINS A R, SUSAN J D, 等. 不同细胞DNA氧化损伤及自身修复能力的分析［J］.癌变·畸变·突变,  1997，9（3）：138.

　　［7］郝慧泉, 周友亚. 茶多酚的抗癌机理研究进展［J］. 广州医药, 2002,33(5):1.

　　［8］箫伟祥. 浅析天然抗氧化剂茶多酚的几个问题［J］.蚕桑茶叶通讯, 1997(1):6.

　　［9］方允中，李文杰. 自由基与酶［M］.北京：科学出版社， 1989:196.

　　（本文编辑  黄建乡）

　　［基金项目］山东省卫生厅（2001CAICBA5）和青岛市科技局（042HH75）资助项目

　　［作者简介］董春景（1978），女，硕士，现工作单位为威海市市立医院。

　　［通讯作者］梁惠（1964），女，硕士，教授，硕士生导师。

　　（青岛大学医学院医学营养研究所，山东 青岛  266021；青岛大学医学院附属医院营养科；中国科学院海洋研究所生物工程中心）