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［摘要］目的探讨扇贝多肽（PCF）对中波紫外线（UVB）辐射损伤HaCaT细胞的作用及对细胞外调节激 酶-丝裂原活化蛋白激酶（ERKs/MAPKs）通路的影响。 方法 建立UVB（20 mJ/cm2）对体外培养的HaCaT细胞 辐射损伤的病理模型，实验分为对照组、模型组、UVB+5.69 mmol/L PCF组、UVB+2.84 mmol/L PCF组、UVB+1.42 mmol/L PCF组和UVB+5.69 mmol/L维生素C组。琼脂糖凝胶电泳观察各组不加入或分别加入 Caspase-3抑制剂（DEVD-FMK）、ERKs通路抑制剂（PD98059）后的细胞凋亡情况;Western blot检测ERKs、MEKs 磷酸化与非磷酸化的活性。 结果 PCF能剂量依赖性地减少UVB所致的HaCaT细胞DNA片段的出现;预先应 用ERKs通路抑制剂可使DNA片段增加;预先应用Caspase-3抑制剂使DNA片段减少;PCF还能提高磷酸化 ERKs、MEKs的活性，但不影响总的ERKs、MEKs的含量。结论 PCF能抑制UVB辐射诱导的细胞凋亡，对 UVB辐射损伤的细胞具有保护作用。其作用通过调节ERKs/MAPKs的信号通路和Caspase级联反应实现。
［关键词］扇贝多肽;紫外线;HaCaT细胞;凋亡;细胞外调节激酶-丝裂原活化蛋白激酶
EFFECTS OF POLYPEPTIDE FROM CHLAMYS FARRERI ON UVB-INDUCED HaCaT CELL APOPTOSIS AND MODULATES ERKS SIGNALING PATHWAYS
YU SHUANG，GUO SHEN-BO，YAN ZHOU-PING， et al
（Department of Pharmacology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）
［ABSTRACT］ Objective To investigate whether PCF could inhibit apoptosis of HaCaT cells induced by ultraviolet B and to examine the effect of PCF on the ERKs/mitogen-activated protein kinases （ERKs/MAPKs） cascade and Caspase-3 in vitro. Methods Cellular experiments were designed into 6 groups （control， model， UVB+5.69 mmol /L PCF， UVB+2.84 mmol/L PCF， UVB+1.42 mmol/L PCF and UVB+5.69 mmol/L Vit C）. Gel electrophoresis was used to observe the DNA ladder of each group with or without Caspase-3 inhibitor， ERKs pathways inhibitor; and Western blot was used to detect the activity of p-ERKs， P-MEKs， ERKs， and MEKs. Results PCF inhibited UVB-induced DNA ladder in HaCaT cells; ERKs pathways inhibitor in- creased the fragment of DNA by UVB; but the inhibition of Caspase-3 reduced the fragment of DNA; PCF enhanced the activity of P-ERKs and P-MEKs， but did not affect the activity of ERKs or MEKs. Conclusion PCF has protective effects against UVB-in- duced apoptotic cell death in HaCaT cells and PCF is likely to exert its cytoprotective effect in HaCaT cells through ERKs/MAPKs activation and caspase cascade.
［KEY WORDS］polypeptide from Chlamys farreri; ultraviolet rays; HaCaT cells; apoptosis; extracellular signal regulated kinases/ mitogen-activated protein kinases
短期集中或长期间断紫外线辐射可引起皮肤损 伤，尤其是日光中的中波紫外线（UVB），与皮肤肿 瘤发生具有一定的相关性，故对紫外线损伤防护作用的研究近年来倍受关注［1］。许多研究结果证明，紫外线照射引起皮肤损伤的发生与诱导表皮细胞凋 亡及激活相关的信号传导通路有关［2］。目前，人们广泛应用抗氧化剂减轻紫外线辐射导致的损伤。然而，抗氧化剂大多具有相对分子质量大、不易吸收的缺点，有的甚至还有毒性。本课题组制备的扇贝多 肽（PCF）属于海洋抗氧化剂，是从栉孔扇贝中提取的水溶性小分子多肽，相对分子质量为879。以往研究表明，它能有效清除化学体系产生的氧自由基，抑制紫外线对人皮肤细胞的氧化损伤［3～6］。为了进一步研究PCF对HaCaT细胞的作用，我们以UVB 辐射损伤的HaCaT细胞为模型，从细胞外调节激 酶-丝裂原活化蛋白激酶（ERKs/MAPKs）通路和半 胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的角度探讨了PCF对 UVB辐射HaCaT细胞的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人类角质形成细胞株HaCaT由韩国延世大学 丁擘晓博士惠赠。完全培养液由DMEM（Gibco公 司）、体积分数0.10的小牛血清（Gibco公司）以及 100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素组成。PCF， 纯度>96%，由中国水产科学院黄海水产研究所提 供，用完全培养液DMEM配制成体积分数0.20的 母液，4 ℃保存备用;MEKs、ERKs、磷酸化MEKs、 磷酸化ERKs抗体购买于Cell Signaling Tech;β肌 动蛋白抗体购买于博士德公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及分组 HaCaT细胞株用完全培养液，置于37 ℃、含体积分数0.50 CO2的饱和水汽培养箱培养。将指数生长期细胞随机分为6组:对照组、模型组、UVB+5.69 mmol/L PCF组（PCF1组）、UVB+2.84 mmol/L PCF组（PCF 2组）、UVB+1.42 mmol/L PCF组（PCF 3组）和UVB+ 5.69 mmol/L维生素C组（Vit C组）。各给药组在加相应药物后培养2h，除对照组外，其他各组细胞 均经UVB（辐射剂量为20 mJ/cm2）辐射，在辐射前 用PBS洗涤2次。辐射后细胞继续培养18 h进行 以下实验。
1.2.2 细胞凋亡的检测
参照文献［7］方法制备5× 107/L细胞悬液，将其接种于6孔培养板，每孔加3 mL细胞悬液 。于培养箱中培养至指数生长期 时，各组不加入或分别在UVB辐射前0.5 h加入 Caspase-3抑制剂（DEVD-FMK）、ERKs通路抑制剂（PD98059），收集细胞，PBS洗2次，加入细胞裂 解液（5 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 20 mmol/LEDTA; 5 g/L Triton X-100），50 ℃孵育1 h，然后 加入RNase A（100 mg/L）50 ℃孵育1 h，再加入蛋 白酶K（200 mg/L）50 ℃孵育1 h，裂解的上清用苯 酚-氯仿-乙醇（25∶24∶1，V∶V∶V ）抽提。收集沉淀，用体积分数0.70的冷乙醇漂洗1次，沉淀溶于1×TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/ L EDTA），提取的DNA样本加入含溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶，60 V电泳1 h后在紫外 线灯下观察并照相。
1.2.3 MEKs、ERKs、磷酸化ERKs、磷酸化MEKs检测
按文献［8］报道的Western blot方法检测。 细胞无血清培养24 h后，直接裂解于裂解缓冲液（含20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.7，250 mmol/LNaCl，2 mmol/L EGTA，5 g/LNP 40 ，100 g/Lglycerol，20 mmol/L 3-glycerphsphate，1 mmol/LNa3VO4）30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清分装。考马斯亮蓝蛋白测定法测定蛋白浓度［8］ 。取 100 μg蛋白经体积分数0.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜。在含体积分数0.01的一抗（MEKs、ERKs、磷酸化-ERKs、磷酸化-MEKs 的单克隆抗体）的封闭液中，4 ℃摇晃过夜;TBST （含 1×TBS ，1 g/L Tween 20）漂洗3次，每次各5 min ;在含1∶2 000稀释HRP标记第二抗体的封闭液中，室温摇晃1 h;TBST漂洗3次，每次5 min; DAB显色。每组实验至少重复3次。应用图像灰 度软件对免疫反应的条带进行显像密度测定。
1.3 统计学处理
计量资料用 x±s 表示，用SPSS软件对结果进 行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 PCF对UVB辐射HaCaT细胞DNA片段的影响
DNA凝胶电泳显示，HaCaT细胞在20 mJ/cm2的UVB辐射剂量和辐射后培养18 h内的条件下，呈现特征的阶梯状DNA凋亡带，而对照组呈现 单一条带。与对照组比较，模型组细胞DNA断裂 明显，呈现特征的阶梯状DNA凋亡带，且梯状带灰度较高;与UVB模型组比较，PCF各组梯状带不明 显，灰度减弱，PCF 3组的图像与对照组相接近（图1a）。当预先给予Caspase-3抑制剂时，UVB模型 组的凋亡带不明显，PCF各组则可完全阻断UVB 辐射诱导的凋亡（图1b）。当预先给予ERKs通路 的抑制剂（PD98059）与PCF共孵育，UVB辐射后 出现典型的凋亡带（图1c）。 2.2 PCF对HaCaT细胞受UVB辐射后ERKs、MEKs活性的影响与UVB模型组比较，各PCF组与Vit C组中 磷酸化ERKs、MEKs活性均有增高，其中在PCF 1 组中磷酸化ERKs、MEKs的活性升高明显，灰度最 深;而Vit C组与PCF 2组中磷酸化ERKs、MEKs 则次之，PCF 3组灰度亦高于UVB模型组，但深度 要比Vit C组与PCF 2组浅。结果表明，PCF可明 显增强磷酸化ERKs、MEKs的活性。而总MEKs、 ERKs各组之间无明显差异。见表1，图2、3。 表1 PCF对UVB辐射后HaCaT细胞MEKs、ERKs活 性影响（ 略）
3 讨 论
由于UVB主要由皮肤表皮吸收，且可以直接 损伤细胞DNA或诱发氧化反应产生自由基而损伤 皮肤，因此被认为是导致皮肤损伤和皮肤癌的主要光谱［9］。故关于UVB对人角质形成细胞的作用，尤其是诱导凋亡的研究越来越多。大多数研究表明，在一定剂量范围内，UVB能以时间和剂量依赖 的方式引起体内及体外培养的角质形成细胞发生凋 亡，但是其剂量和时间范围不尽一致。本实验的结果表明，20 mJ/cm2的UVB剂量辐射后培养18 h，UVB能以时间和剂量依赖的方式引起角质形成细胞发生凋亡。细胞凋亡时主要的生化特征是染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接 处断裂，形成50～300 kbp长的DNA大片段，或180～ 200 bp 整数倍的寡核苷酸片段，凝胶电泳检 查结果出现梯形电泳图谱（DNA Ladder），而正常细 胞DNA呈单一条带，坏死时则呈模糊的弥散状条带［10］，所以DNA Ladder被认为是凋亡特征性指标。本实验研究结果表明，PCF具有抗HaCaT细胞凋亡的作用。UVB辐射损伤的HaCaT细胞呈 典型的凋亡生化改变，这种改变在模型组最为明显。用不同浓度的PCF预处理可减轻细胞受损，以5.69 mmol/L 的PCF效果为优（DNA表现为单一 条带），说明PCF对UVB损伤HaCaT细胞具有保 护作用。 Caspase是近年来发现的哺乳动物细胞凋亡相 关蛋白酶，现已发现的该家族10个成员中，最引人 瞩目的是Caspase-3。根据GenBank人类EST（ex- pressed sequencetag）提供的信息，采用PCR方法， FERNANDES-ALNEMRI等 ［11］于1994年从人类 Jutkat T细胞系中克隆出Caspase-3基因，并证明 其与该家族第一个被发现的成员ICE（interleukin-1;3-converting enzyme）有同源性。大量的实验证明，细胞凋亡是一个复杂的、由Caspase家族成员介 导的蛋白酶级联反应过程。Caspase蛋白酶在组织 分布和降解已知底物的功能上彼此有重叠现象，但在不同组织细胞或同一细胞受同一刺激诱发凋亡过 程中，激活的Caspase不尽相同。但普遍认为，该家 族成员Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶［12］。在Caspase家族中Caspase-2、8、9、10等属 于上游，Caspase-3、6、7处于下游，其中Caspase-3/7 是细胞凋亡最后的共同途径［13］。SHIMLZU等［14］使用25 mJ/cm2UVB对人KC细胞进行辐射诱导 凋亡过程中，预先将细胞用Caspase-3抑制剂处理后，UVB诱导的凋亡被抑制了60%，提示Caspase- 3在UVB诱导KC细胞凋亡中具有一定作用。本文结果表明，UVB能够诱导HaCaT细胞的凋亡，但预先给予Caspase-3抑制剂，琼脂糖凝胶电泳显 示DNA Ladder形成明显降低。提示Caspase-3参 与了PCF对抗UVB辐射诱导的HaCaT细胞的凋 亡效应。ERKs是MAPKs主要成员之一，ERKs是一种胞浆内广泛分布的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，以往的研究认为，ERKs主要与细胞增殖和分化密切相关［15］。但近年的研究发现，ERKs还参与细胞凋亡的调节。FAN等［16］研究结果表明，抗氧化剂通过激活ERKs途径保护中性粒细胞不发生凋亡。鉴于ERKs信号通路在UVB诱导HaCaT细胞凋亡过 程中的作用尚不明确，更重要的是ERKs信号通路是否参与了PCF抗UVB辐射诱导的HaCaT细胞 的凋亡效应?本文研究了PCF对UVB辐射前后 HaCaT细胞中磷酸化与非磷酸化MEKs、ERKs含 量的影响，以明确PCF抗UVB辐射诱导的HaCaT细胞的凋亡效应中ERKs信号通路的作用。实验结 果显示，预先给予特异性抑制ERKs通路的抑制剂 PD98059，琼脂糖凝胶电泳显示DNA Ladder明显 地增多。结果提示抑制ERKs通路增强了UVB诱 导的HaCaT细胞的凋亡，确证了ERKs信号通路 在UVB诱导凋亡中的作用，即ERKs信号通路的 失活能引起随后的HaCaT细胞的凋亡;而各PCF组电泳结果显示DNA Ladder明显地增多，表明PCF抗UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用是通过 ERKs信号通路实现的。为了进一步阐明PCF对ERKs信号通路的影响，本文应用Western blot方法，使用抗ERKs和 MEKs特异性双磷酸位点抗体检测发现，HaCaT细 胞在受到UVB（20 mJ/cm2）刺激后，细胞内磷酸化ERKs、MEKs显著降低，而与UVB模型组比较，1.42 、2.84、5.69 mmol/L PCF组中磷酸化ERKs、MEKs活性均明显增高，并且以5.69 mmol/L PCF组磷酸化ERKs、MEKs活性升高最明显。但使用总ERKs、MEKs抗体研究发现，在UVB辐射后，ERKs、MEKs的总量并无明显变化，而PCF能剂量依赖性增强ERKs、MEKs的磷酸化水平，证明ERKs、MEKs以活化形式参与了PCF抗UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的作用。提示PCF抗UVB的氧化损伤作用机制在于激活ERKs信号级联，即 增强了活化的Raf对MEKs的磷酸化，从而进一步使ERKs磷酸化，磷酸化ERKs使细胞内相关的转录因子磷酸化而发挥作用。本文在建立UVB（20 mJ/cm2）对HaCaT细胞氧化损伤和凋亡的模型基础上，首次在ERKs/MAPKs信号传导通路和Caspase-3级联通路上探 讨了PCF对紫外线损伤HaCaT细胞的保护作用机 制。PCF抗UVB辐射诱导的HaCaT细胞的凋亡效应，是通过增强ERKs、MEKs激酶的磷酸化水平来实现的，同时Caspase-3级联亦参与了PCF的保护作用。
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［基金项目］ 国家自然科学基金（No.30471458）和山东省自然 科学基金（No.Y2003c02）资助项目
1 青岛大学医学院药理学教研室，山东 青岛 266021;
2 海慈医疗集团;
3 中国水产科学院黄海水产研究所