康寿灵含药血清对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

　　［摘要］目的　观察康寿灵含药血清对过氧化氢（H2O2 ）诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。方法采用体外细胞培养的方法，建立SH-SY5Y神经细胞H2O2损伤模型。通过观察细胞形态，测定细胞存活率（MTT  法）、乳酸脱氢酶（LDH）活性，检测康寿灵含药血清对SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。结果 同模型组比较，体积分数为0.05、0.10、0.15的康寿灵含药血清能减轻H2O2引起的SH-SY5Y神经细胞的损伤，明显提高细胞的存活率，减少LDH的释放量。结论 康寿灵含药血清对H2O2 诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有明显的保护作用。   

　　［关键词］康寿灵;过氧化氢;SH-SY5Y神经细胞;药物作用

　　PROTECTIVE EFFECT OF KANGSHOULING-CONTAINING SERUM ON DAMAGE OF CULTURED SH-SY5Y CELLS IN VITRO   INTRODUCED BY HYDROGEN PEROXIDE 

　　LIU HONG-LING， SUN XIANG-HONG， JIANG HUI-QING， et al  

　　（Depart-ment of Pharmacy，The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003，China）  
　　［ABSTRACT］ Objective  To investigate the protective effect of Kangshouling-containing serum on the damage of cultured   SH-SY5Y cells.  Methods The damage of cultured SH-SY5Y cells was made by hydrogen peroxide. The protective effect of   Kangshouling-containing serum was observed by morphological identification， colorimetric MTT assay， and LDH activity.   Re-sults  Kangshouling-containing serum （0.05，0.10，0.15 ） can relieve the damage of SH-SY5Y cells and increase the survival of the cells， and lower their LDH release.   Conclusion  Kangshouling-containng serum can strongly protect the cultured SH-SY5Y cells   from damage induced by hydrogen peroxide.  

　　［KEY WORDS］Kangshouling; hydrogen peroxide; SH-SY5Y cells; drug effects     

　　随着世界范围老年人口的不断增加，痴呆严重影响到老年人的生活质量，引起老年痴呆的主要疾  病Alzheimer病（AD）成为近年的研究热点。AD是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力受损为主的中枢神经系统退行性疾病。目前对AD发病机制尚  不清楚，但对其机制研究已有多种学说，如基因学说、胆碱能学说、β淀粉样蛋白学说、能量代谢学说、雌激素学说等。然而这些学说各自独立，互不交叉，而氧自由基学说与上述部分学说有关联，或共同作用，或互为因果及前提条件。近年来越来越多的证  据也显示，多种神经退行性病变与氧化应激密切相关［1］。本文采用血清药理学方法，研究了康寿灵含药血清对过氧化氢（H2O 2）导致的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。   

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器     

　　倒置相差显微镜（Olympus CK40）产于日本;  酶标仪由奥地利TECAN公司生产;细胞培养箱为  德国Heracell公司产品;超净工作台由上海力申科  学仪器有限公司生产;半自动生化分析仪由上海安  泰分析仪器有限公司生产。   

　　1.2 药品与试剂  

　　康寿灵（主要含有炙首乌、黄芪、党参、灵芝、红景天等中药，生药含量为2 700 g/L）由青岛大学医学院附属医院制剂室提供;DMEM培养基、胰蛋白  酶、标准胎牛血清（FBS）均为Hyclone公司产品;溴化-（4，5-二甲-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为美国Sigma公司产品。

　　1.3 动物及细胞来源 

　　健康新西兰大白兔，雄性，体质量1.6～2.3 kg ，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。SH-SY5Y神经细胞株由瑞典卡洛林斯卡医学院张晓教  授惠赠。   

　　1.4 方法  

　　1.4.1  康寿灵含药血清的制备

　　新西兰大白兔6只，随机分为空白组、康寿灵药物组，每组3只。空  白组每日灌服生理盐水，药物组每日灌服中药（剂量 以“人与动物间按表面积折算的等效剂量比值表”计算，为常规用量10倍），每日2次，连续给药10 d，于末次灌胃1 h后无菌条件下取血，3 000 r/min离心  15 min分离血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，然后于56 ℃下灭活30 min，分装后-20 ℃保存［2，3］    。  

　　1.4.2  SH-SY5Y神经细胞的培养 SH-SY5Y神经细胞用体积分数0.10的胎牛血清并添加1×105U/ L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，置37 ℃体积分数0.05的CO2细胞培养箱中  进行培养，每3 d传代1次。

　　1.4.3  筛选H2O2  

　　最佳成模浓度 将SH-SY5Y细胞按5×107/L的浓度接种至96孔板，细胞生长  汇合率达70%～80%时，换成含体积分数0.10的兔空白血清DMEM培养液，继续培养24 h，加入不同浓度的H2O2（终浓度分别为110、120、130、140、150、160、180、200、220 μmol/L），每个浓度设定平  行的8个孔，继续培养24 h，每孔加5 g/L MTT20 μL ，置于37 ℃体积分数0.05的CO2细胞培养箱中孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL ，振荡后于测定波长570 nm，参比波长630 nm 处测定吸光度。以空白对照组的平均吸光值为100%，其余各组均与之相比即得细胞存活率。  

　　1.4.4  康寿灵含药血清对H2O2损伤细胞模型存活率的影响

　　细胞培养方法同前，至96孔板细胞生长汇合率达70%～80%时，换成含体积分数0.05、0.10、0.15的（空白或药物）兔血清DMEM培养液，继续培养24 h，再加入终浓度为140 μmol/L的  H 2O2继续培养24 h后，用MTT法测定细胞的吸光度（细胞的存活率与其吸光度值呈正比）。  

　　1.4.5  康寿灵含药血清对H2O2损伤细胞模型乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响

　　将SH-SY5Y细胞按6×107/L的浓度接种至24孔板，当细胞生长汇合  率达到70%～80%时，换成含体积分数0.05、0.10、0.15的（空白或药物）兔血清DMEM培养液，继续培养24 h，再加入终浓度为140 μmol/L的H2O2   继  续培养24 h后，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶（LDH）的活性。以LDH的活性代表LDH的漏出率;LDH释放抑制率按如下公式计  算:抑制率=（LDH模型组-LDH药物组）/（LDH模型组-LDH对照组）×100%。   

　　2 结  果   

　　2.1  培养SH-SY5Y神经细胞形态的变化   

　　倒置显微镜下观察，正常的SH-SY5Y细胞折光性强，轴突清晰可见，贴壁状态良好;加入H2O2造模培养24 h后，细胞折光度下降，突触收缩，贴壁  不良，有许多细胞呈悬浮状;而预先给予康寿灵含药血清培养，可改善造模细胞形态，表现为细胞突触结  构消失减少，细胞贴壁状态改善。   

　　2.2  不同H2O2浓度对SH-SY5Y神经细胞活性的影响  

　　H2O2终浓度为110、120、130、140、150、160、180、200、220 μmol/L各组及空白对照组测得的吸光度值分别为0.783±0.047、0.772±0.032、0.763±0.023、0.737±0.041、0.712±0.035、0.711±0.037、0.690±0.027、0.667±0.103、0.643±0.087、0.810±0.020。

　　从结果可以看出，在110～220 μmol/L浓度范围内，随过氧化氢浓度的增加，细胞的活性基本呈梯度下降;130～220 μmol/L浓度各组细胞的活性与空白对照组比较，差异均有显著性（ F=9.055，q= 3.792～8.022，P <0.05、0.01）。
       
　　2.3  康寿灵含药血清对H2O2损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响  

　　结果见表1。SH-SY5Y细胞预先用不同浓度  的含药血清（体积分数0.05、0.10、0.15）孵育24 h，再加入140 μmol/L H2O2处理，与预先用空白血清孵育的细胞相比，其测得的吸光度值明显增大，说明预先用药物血清处理可明显减轻H2O2对细胞造成的损伤;与模型组相比，0.05、0.10、0.15药物组吸光度值明显增大，差异具有显著意义（ F=7.898～9.048 ，q=1.839～6.788，P <0.05、0.01）。表1 康寿灵含药血清对H2O2损伤细胞活性的影响（略）

　　2.4  康寿灵含药血清对H2O2损伤细胞模型LDH活性的影响  

　　细胞受损时LDH释放于培养上清液中，上清  液LDH水平反映出细胞损伤或死亡程度。SH-SY5Y细胞损伤后培养液中的LDH 明显增加，与空白组比较差异有显著性（ F=47.453，q= 17.913，P <  0.01）;预先给予不同浓度含药血清（体积分数0.05 、0.10 、0.15 的康寿灵）培养可明显抑制LDH 释放，与模型组比较差异有显著性（ q=2.894～6.614 ，P<0.05、0.01）。药物组抑制率见表2。表2 康寿灵含药血清对H2O2损伤细胞培养液中LDH活性的影响（略）

　　3 讨  论  

　　由于AD的病因和发病机制尚未明确，目前尚  无理想有效的防治措施。并且老年痴呆起病缓慢、发病日久、呈进行性发展，病人又多伴有各种并发  症，需长期服药，而西药效果不理想，且有毒副作用，因此从疗效好、副作用少、兼顾面广、能长期服用的  中药复方中开发防治老年痴呆的方药，越来越受到人们的重视。祖国医学认为，老年性痴呆的主要病  因病机可归纳为肾虚精亏，髓海空虚，痰瘀交结，阻于脑络，络损神伤，发为呆病。补肾填精、调和气血、化瘀通络之法是主要治则。根据中医基础理论，结合现代中药药理，康寿灵中药复方由炙首乌、黄芪、党参、当归、灵芝、红景天、川芎等药味组成。方中炙首乌补肝肾、益精血，黄芪、党参、当归补中益气、健脾益肺、补血活血，灵芝、红景天补气安神、清肺化痰，川芎活血行气、疏通脑络，全方调补为主，辅以清通，以起到强记增慧、延缓脑衰老的作用。体外细胞培养所需样品量少，研究周期较短，实验条件可严格控制，既可直接观察细胞形态、生物化学改变以及药物的保护作用，又可避免在体实验诸多复杂因素的影响，所以体外神经细胞培养已成为神经科学研究中的有力手段。本实验所用的SH-SY5Y细胞为人多巴胺能神经母细胞瘤株，被广泛应用于不同的神经生化研究领域［4，5］ 。血清药理实验方法的最大优点是体外和体内实验结果的一致性，它不仅可反映药物中可吸收部分的直接作用，同时也可反映药物在机体作用下形成代谢产物以及药物诱生的机体内源性物质的间接作用，并且排除了粗制剂中非有效成分对实验结果的干扰［6，7］    。     
　　MTT比色微量分析是一种检测细胞生长和存活的灵敏方法，重复性好。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，  而死亡细胞则无此功能。通过测定吸光度即可反映细胞活性。细胞膜通透性的改变是细胞损伤的一个共同特征，神经细胞损伤程度与LDH释放量呈正比，故测定培养液中LDH活性可作为反映细胞损伤的一种敏感且较为简便的指标。本研究结果表明，SH-SY5Y细胞经H2O2处理后，细胞折光度下降，突触收缩，贴壁不良，有许多呈悬浮状，细胞存活率明显下降，而LDH的释放显著增加。说明H2O2造成了SH-SY5Y神经细胞的自由基紊乱，进而造成细胞损伤。选用140 μmol/L的H2O2损伤细胞，可建立较好的细胞氧化损伤模型;在此条件下，应用该细胞模型研究发现，康寿灵含药血清能有效地降低H2O2对SH-SY5Y神经细胞的损伤，与模型组相比细胞形态明显改善，表现为减少细胞突触的收缩，改善细胞贴壁状态，并且明显提高细胞的存活率和减少LDH的释放，保护SH-SY5Y神经细胞。提示SH-SY5Y细胞在H2O2造模损伤条件下，细胞膜受损，LDH外溢，自由基代谢紊乱，导致毒性物质的积聚，进一步损伤SH-SY5Y细胞。康寿灵含药血清有明显的抗H2O2对SH-SY5Y神经细胞损伤作用。因此，该复方在治疗老年性痴呆方面值得进一步研究。    

　　［参考文献］   

　　［1］张均田. 老年痴呆的发病机理及治疗策略［J］. 药学学报，    2000，35:368.
     
　　［2］贺玉琢. 日本汉方药“血清药理学”、“血清药化学”的研究概况［J］.  国外医学:中医中药分册，1998，20（5）:3.
     
　　［3］李军昌. 中药复方药理的研究工具—— —血清药理学［J］.  中药  药理与临床，  1998，14（6）:26.
      
　　［4］TIEU K， ZUO D M， YU P H. Differential effects of stauros-porine and retinoic acid on the vulnerability of the SH-SY5Y  neuroblastoma cells:involvement of bcl-2 and p53 proteins［J］. J Neurosci Res， 1999，58（3）:426.  

　　［5］NAOI M， MARUYAMA W， AKAO Y， et al. Mitochondria   determine the survival and death in apoptosis by an endogenous   neuroto-xin ，N-methy1（R） salsolinol，and neuroprotection by   propargy-lamines ［J］. J Neural Transm， 2002，109（5/6）:607. 

　　［6］李仪奎，吴健宁. 血清药理实验中采血时间的通法方案［J］.  中  国药理学通报，  1999，15（6）:569.
     
　　［7］包金凤，刘国卿，李子中. 脑力智宝对PC红细胞缺血性损伤的  保护作用［J］.  中国药科大学学报，  2000，31（2）:126. 

　　1 青岛大学医学院附属医院药剂科，山东 青岛 266003;

　　2 青岛大学医学院药理学教研室