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［关键词］ 辐射;信号转导;凋亡;综述
随着核技术在工农业、医学、生命科学等方面应用的迅速发展，人们与放射线接触的机会日益增多，遭受辐射损伤的可能性随之增加。辐射作为贯穿性刺激因素，最先接触到的是细胞膜，可启动膜的信号传递;继之，射线通过胞质时，又影响位于胞浆内的信号转导分子，干预正常的胞内信号转导途径;当射线到达胞核时，直接损伤DNA分子，随后可活化多种蛋白质分子，激活相应的信号转导途径。本文拟对辐射所触发的细胞信号转导途径的研究进展作一综述。
1 DNA损伤介导的凋亡信号转导通路
目前认为辐射致DNA损伤后，有3种酶被激活: 毛细管扩张失调症突变激酶 （ATM）、ATM相关激酶 （ATR） 和DNA依赖的蛋白激酶 （DNA-PK）。电离辐射时，ATM使p53第15位上丝氨酸残基磷酸化，破坏了p53与 Mdm-2的相互作用，取消了Mdm-2对p53的抑制作用，导致p53稳定性和活性增强。DNA-PK可激活p53基因，导致细胞周期阻滞、DNA修复或诱发细胞凋亡。p53激活可通过线粒体和死亡受体两种途径导致细胞凋亡［1］。
1.1 线粒体通路 线粒体功能改变与细胞凋亡密切相关，包括释放促凋亡因子、活性氧 （ROS） 过度生成、胞浆内钙失衡等。
1.1.1线粒体促凋亡因子的释放和调节 p53上调Bax的表达，Bax转移到线粒体外膜，诱导线粒体释放促凋亡蛋白，这类促凋亡因子主要有两种: 细胞色素C（cyto C） 和凋亡诱导因子 （AIF）［2］。正常情况下，cyto C定位于线粒体膜间隙，不能通过外膜。成熟的cyto C既是细胞生存的必需分子，又是细胞死亡的启动分子。在ATP或dATP存在的情况下，cyto C释放入胞浆，与凋亡蛋白酶激活因子1 （Apaf-1） 羧基端的WD重复序列以2∶1比例形成Apaf-1/ cyto C复合体，并促使Apaf-1构象发生变化形成寡聚体。由于Apaf-1与半胱氨酸蛋白酶9 （caspase 9） 前体之间具有同源结构域，通过蛋白质-蛋白质相互作用，Apaf-1募集胞浆中的caspase 9前体并以1∶1的比例与之结合，形成凋亡小体 （apoptosome），又称为“诱导死亡信号复合体”（DISC）。聚合的caspase 9前体通过自我活化产生了具有活性的caspase9，caspase 9再酶解caspase 3前体，释放出C末端小肽片段，从而活化caspase 3，活化的caspase 3再瀑布式激活caspase 2、6、8、10等［3，4］;活化的caspase 3反过来又能激活caspase 9酶原，形成正反馈通路。caspase 9又可激活caspase 7，caspase 3和caspase 7都是凋亡过程的主要水解酶。caspases是一组与秀丽隐杆线虫同源的执行哺乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族，通常它们以无活性的酶原形式存在于胞质内，当有致凋亡刺激存在时被激活。凋亡程序一旦开始，caspase被激活经随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应，caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，导致细胞染色质的固缩。caspase 3是caspase家族最重要的凋亡执行者之一，它可自身切割，在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切作用 （激活或灭活）。Nagata实验室在胞质内找到一种能将染色质切割的核酸酶-脱氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），该酶需首先藉caspase 3激活，故称caspase activated DNase （CAD）［5］，而把它的抑制物称为ICAD。正常情况下，CAD-ICAD以无活性的复合物形式存在，ICAD一旦被caspase水解，即赋予CAD核酸酶活性，使DNA片段化。这些激活的caspase最终激活了CAD/DFF45，水解核酸及细胞骨架蛋白，CAD能在DNA上识别一定的序列并在该处使其断裂而成“梯形染色质”（chromat-inladder），一般认为这是凋亡的典型表现。线粒体释放cyto C受Bcl-2蛋白家族调控。如前述，cy-to C释放能大量激活caspase 3，它可再激活caspase 8，而激活的caspase 8能在胞浆中激活Bcl-2蛋白家族成员Bid，激活后的Bid转位至线粒体膜上，引起线粒体在核周聚集，释放cyto C，形成正反馈通路［6］。Bcl-2和Bcl-Xl则能抑制caspase自身正反馈激活，从而抑制凋亡。 凋亡诱导因子（AIF）是线粒体释放到胞浆的另一促凋亡因子，是一种黄素蛋白，它与细菌的铁氧化还原蛋白及NADH氧化还原酶同源，其氨基末端具有一段线粒体靶序列。当线粒体在腺苷移位酶 （ANT） 的激动剂苍术苷 （at-ractyloside）、Ca2+或叔丁基过氧化物作用下，线粒体外膜蛋白聚合形成膜通透转运孔 （PTP） 复合体，导致外膜非特异性断裂，AIF自线粒体膜间隙释放。当细胞受凋亡刺激后，AIF自线粒体膜间隙转位到胞浆，并最终转位到细胞核，同时随着线粒体跨膜电位（Δψm）下降，细胞呈现出凋亡的形态学改变。cyto C从线粒体转位到胞浆，需在Apaf-1、ATP及caspase 9酶原共同作用下诱导细胞凋亡，而AIF则不依赖caspase，直接作用于细胞核，导致核凋亡。AIF还可导致线粒体肿胀，改变线粒体外膜的通透性; 释放入胞浆的AIF可 作用于其他线粒体，使之通透性增加。因此，AIF是线粒体膜通透性改变与核凋亡之间的重要桥梁。 活化的caspases反过来也可直接作用于线粒体外膜，引起外膜通透性增强，PTP开放，Δφm崩溃和外膜破裂，有利于细胞色素C释放。凋亡时Δφm崩溃，线粒体内膜通透性增加是凋亡信号传导的早期事件。目前研究表明，线粒体内外膜上都有PTP，包括内膜上的ANT［7］，外膜上的电压依赖性阴离子通道 （VDAC）［8］等，当PTP开放时，允许相对分子质量<1 500的分子通过;内膜两侧离子梯度消失，导致Δφm崩溃。线粒体膜内相对高渗，PTP开放后水分到达线粒体基质，使基质肿胀，嵴断裂，释放出膜间促凋亡蛋白。但有研究发现，cyto C释放可在Δφm崩溃之前，而且，凋亡期间只有部分线粒体外膜破裂，提示cyto C等释放还有其他机制。 Bcl-2蛋白家族在线粒体膜上的表达可影响cyto C的释放。Bcl-2家族相关蛋白分为两类: 一类具有抗凋亡功能，如Bcl-2和Bcl-Xl;另一类具致凋亡作用，如Bax、Bak、Bid、Bad。在空间联系上，线粒体膜上发现了Bcl-2家族蛋白物质，通过控制cyto C释放而调控凋亡。在功能联系上，Bcl-2家族成员可以影响PTP的开放和AIF的释放。促凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-Xl等可以抑制PTP的功能，减少cyto C和AIF的释放，并通过与线粒体内膜控制离子转运的蛋白发生功能性或生理性的联系，导致氢离子从线粒体中泵出，抑制由于呼吸链脱耦联所导致的基质钙离子的释放，提高线粒体的钙缓冲能力。促凋亡蛋白Bax等则可以促进PTP的功能，增加cy-to C和AIF的释放，从而介导凋亡的发生［9］。研究发现，Bcl-2如在线粒体外膜上高表达，一方面与Bid、Bax结合，抑制cyto C释放的正反馈机制;另一方面，它有“质子泵”的功能，使线粒体内呼吸产生的H+ 外泵至胞浆，维持跨膜电位Δφm，减少ROS生成，抑制凋亡［10］。
1.1.2ROS过度生成 电离辐射可使细胞内产生ROS，当细胞内ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力减弱时，ROS能与蛋白质、DNA和脂质体反应，引起蛋白质的一些氨基酸残基或DNA碱基发生氧化破坏，DNA链断裂，细胞膜起泡，脂质过氧化等，导致细胞凋亡［11］。病理情况下，线粒体生成的过量ROS，已被公认是诱导凋亡的递质。
1.1.3胞内Ca2+失衡 线粒体内Ca2+较丰富，当线粒体膜损伤后，Ca2+可通过多种途径进入胞浆，启动凋亡相关途径，如激活一氧化氮合酶（NOS）、Ca2+依赖酶;Mg2+/Ca2+可共同激活核酸内切酶，裂解DNA链，形成各种DNA片段，诱导凋亡的发生。细胞凋亡早期胞内［Ca2+］升高，通过钙调蛋白激活蛋白激酶C等，使信号得以传递及放大。用Ca2+释放剂咖啡因可引起Ca2+释放，引起DNA链断裂，细胞凋亡;相反，Ca2+螯合剂或Ca2+通道阻断剂则可降低胞内［Ca2+］，阻止DNA断裂和细胞凋亡［12］。此外，Ca2+能激活一系列与线粒体介导凋亡有关的蛋白，如蛋白磷酸酯碱酶、钙神经碱（calcineurin），被Ca2+激活后使Bad去磷酸化，Bad与Bcl-Xl亲和力增高，解离出Bax诱导凋亡;高浓度Ca2+能使NF-κB表达增高，p53表达增加，下调Bcl-2在线粒体膜上的表达，从而诱导凋亡;高浓度Ca2+可加速PTP开放，而PTP可作为Ca2+慢通道，一过性释放线粒体内Ca2+诱导凋亡。有研究表明，Ca2+浓度的降低可相应降低细胞的凋亡率［13］。
1.2 死亡受体通路 死亡受体属肿瘤坏死因子受体（TNFR） 超家族，包括Fas/CD95/Apo-1、TNFR1 （又称P55或CD120a）、B细胞抗原CD40等，死亡受体其细胞外部具有3～6个富含半胱氨酸的结构区，细胞内同源部分称“死亡域”（DD）。
1.2.1Fas/CD95信号传导 有关Fas介导凋亡的下一级信号传递，可能存在两条途径: 一是Fas通过其胞内段所含死亡域与胞内衔接子蛋白FADD作用，FADD有两个相互联系的死亡域，即死亡结构域（DD）和死亡效应域，DD与死亡受体结合;而死亡效应域与procaspase 8结合，从而激活caspase 8而导致细胞凋亡［14］。电离辐射可通过p53依赖的方式诱导死亡受体Fas及其配体FasL （即CD95L或CD178） 的表达。FasL是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD募集胞浆中的衔接蛋白FADD和caspase 8。Fas、FADD和caspase 8形成了死亡诱导信号复合体。激活的caspase 8能在胞浆中裂解Bid，裂解产物的羧基端片段 （tBid） 转移到线粒体上，诱导线粒体释放cyto C。Bid的裂解把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地放大了凋亡信号。二是通过神经酰胺作为第二信使发挥诱导细胞凋亡作用。其大致途径为:Fas与FasL结合，活化神经鞘磷脂酶，分解神经鞘磷脂而产生神经酰胺，再激活一系列神经酰胺依赖性蛋白激酶，启动了胞内磷酸化过程，最终导致DNA降解及细胞凋亡［15］。
1.2.2TNFR信号转导 TNF与其受体结合，导致细胞内DD相聚，然后再与TRFR相关死亡域 （TRADD） 结合。TRADD一方面结合FADD诱发细胞凋亡，另一方面结合受体相关蛋白 （RIP）。RIP再与TNFR相关因子2 （TRAF-2） 结合，激活细胞内抑制细胞凋亡的机制，并激活免疫和炎症反应JNK/AP1通路。
1.2.3死亡受体DR3信号转导 与TNFR1相似，DR3与其配体Apo3L结合后即可通过FADD激活细胞凋亡过程，通过TRADD-TRAF途径激活NF-κB抑制细胞凋亡。
2 MAPK、Akt/ PKB信号转导通路
辐射作用于细胞膜受体，通过激活丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路和抑制Akt/ PKB信号通路协同作用诱导细胞凋亡。
2.1 MAPK信号通路 MAPK通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，并在细胞恶性转化等病理过程中起重要作用。MAPK级联的核心是3个Ser/ Thr蛋白激酶: MAPK、MAPKK（MKK或MEK）和MAPKKK（MKKK或MEKK）。级联的主向为MAPKKK→MAPKK→MAPK。信号转导通过有丝分裂原激活蛋白激酶途径包括三条高度同源但并不一样的生化级联途径，即c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路、p38MAPK通路和细胞外信号调节激酶（ERK） 通路。JNK/SAPK信号转导途径和p38MAPK信号转导途径主要是被炎症细胞因子如TNFα和IL-1等以及多种类型的细胞应激信号所激活，并导致应激激活蛋白激酶的激活;ERK1/2信号转导途径是被有丝分裂原和生长因子强烈激活并导致MAPK （MAPK/ERK） 的细胞外信号调节激酶家族的激活，对细胞的生长、分裂和分化信号进行传导，主要与细胞增殖有关。
2.1.1SAPK/JNK通路 SAPK/JNK途径参与了辐射诱发凋亡的信号转导。SAPK/JNK途径传导细胞应激、炎性细胞因子、紫外线、蛋白质合成抑制剂、渗透压应激等信号。JNK分为3个亚型: JNK1、JNK2和JNK3。 JNK诱导细胞凋亡的确切分子机制仍不十分清楚，可能有四方面:①活化的SAPK/JNK激活转录因子c-Jun（Ser63/Ser73），JNK通过磷酸化c-Jun，使之结合到TRE/AP-1元件启动转录;②活化的SAPK/JNK也可激活下游的转录因子ATF-2/CRE-BP1（Thr69/Thr71），ATF-2结合到AP-1和CRE DNA反应元件启动转录;因此，JNK通过磷酸化c-Jun和ATF-2激活转录因子AP-1（AP-1是Jun -Jun、Jun- Fos或Jun- ATF的二聚体），Fas配体的启动子包含有AP-1和NF-κB顺式作用元件;③活化的SAPK/JNK还可激活转录因子Elk-1;④JNK介导细胞凋亡的另一途径是通过磷酸化Bcl-2和Bcl-Xl，促进线粒体释放细胞色素C，激活caspase级联反应，导致细胞凋亡［16］。
2.1.2p38MAPK通路 该通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程。在紫外线、高渗、炎性因子等作用下，依次激活MEKK1、SEK1/MKK4/JNKK、p38MAPK（Thr180/Tyr182）。MKK3（Ser189/Thr193）/MKK6（Ser207/Thr211）也是p38MAPK的上游激酶。p38MAPK被磷酸化活化，活化的p38MAPK继而激活MAPKAPkinase-2;活化的p38MAPK还可通过磷酸化活化转录因子，激活转录因子Elk-1、ATF-2、Max和CREB，调控特定基因的表达，从而将信号从细胞外传导到细胞核［17］。p38级联通路为: MEKK4→ASK1→TAK1或TAO1/2→MKK3/6→p38。p38抑制剂SB203580、SB202190或PD169316可减轻或抑制细胞凋亡。
2.1.3ERK通路ERK可分为4个亚型: ERK1（p44MAPK）、 ERK2（p42MAPK）、ERK3和ERK5（BMK）。生长/分化信号如生长/神经营养因子、神经递质、细胞因子、膜去极化、钙内流等通过生长因子受体和酪氨酸激酶介导，依次激活Ras、c-Raf（Ser259/Ser621）、MEK1/2（Ser217/Ser221）、ERK1/2（Thr202/Tyr204，人ERK1）激酶。活化的ERK1/2激活转录因子Elk-1（Ser383），Elk-1结合到SRE启动转录;活化的ERK1/2也可激活转录因子Stat3（Ser727，小鼠）或c-Myc（Thr58/Ser62），c-Myc结合到E-Box启动转录;活化的ERK1/2还可激活p90RSK（Ser381）。一般认为ERK的级联反应主要导致细胞增殖［18］，在某些细胞中，细胞凋亡就是 通过激活JNK和p38并同时抑制ERK活性而实现的。近年来研究发现，ERK具有细胞周期阻滞、抗细胞增殖和促细胞死亡等多种生物学活性。
2.2 Akt/ PKB信号通路 Akt/ PKB的抑制作用可通过PI-3K依赖的和非PI-3K依赖的两种方式进行。成纤维细胞中，紫外辐射激活酸性鞘磷脂酶，产生神经酰胺，抑制PI-3K活性，PI-3K可激活Akt。 PI-3K抑制剂（wortmannin，LY294002）通过抑制Akt诱导细胞凋亡。越来越多的证据表明，细胞信号转导途径之间存在着各种各样的相互通讯（cross talk），细胞信号转导途径之间又都存在着不同程度的联系，从而形成一个非常复杂的、完整的网络状信号转导调控模式。特定的输入信号在通过这一网络传输信号时，信号的强度或（和）时间会被修饰或调控，从而引发不同的生理效应。通过这一网络状的信号转导系统，使细胞能更精确地进行信号转导和调控，以适应内外环境中各种信号的变化。由此可见，一条途径的激活可导致另一条途径的激活，从而协同完成对细胞生长、分化和凋亡的调控。通过对辐射诱导的凋亡细胞信号转导通路的研究，能使我们更好地理解辐射所引起的凋亡信号转导途径，为进一步完善辐射防护和治疗提供新思路。
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（本文编辑 马伟平）
［基金项目］国家自然科学基金（30471458 ）、青岛市科技局 （2000-260、 03-2-JZ-03 ） 及山东省教育厅 （ J04E17） 资助项目
（青岛大学医学院药理学教研室; 青岛大学医学院附属医院药剂科; 中国海洋大学医药学院）