大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究

【摘要】  目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的条件。方法 采用全骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察及碱性磷酸酶活性、细胞矿化作用、骨钙素(OCN)等的测定。结果 原代培养的BMSCs先形成细胞集落,14 d时集落融合; 传代细胞体积变大,约5～7 d传代1次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。经过体外成骨诱导的BMSCs 表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征。在矿化期OCN 表达呈阳性。结论 BMSCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨定向诱导的BMSCs 具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。

【关键词】  骨髓间充质干细胞;诱导分化；细胞培养；碱性磷酸酶；骨钙素

    EXPERIMENTAL STUDY OF CULTIVATION, IDENTIFICATION AND INDUCED DIFFERENTIATION OF BONE MARROW STROMAL STEM CELLS INTO OSTEOBLASTS IN RATSLIU BINYU， LI NINGYI， FAN GONGWEI，  et al（Department of Stomatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China） ［ABSTRACT］ObjectiveTo set up a protocol of culturing bone marrow stromal stem cells （BMSCs） of rats in vitro, and to study the condition for induced differentiation to osteoblasts.  MethodsBMSCs were isolated from adult rats for anchoring culture. The passage cells were induced to differentiate into osteoblasts in a differentiation induction medium. The phenotype was determined by morphological method，and levels of alkaline phosphatase (ALP） and osteocalcin (OCN), and ability to form mineralized nodules were examined. ResultsColonies of BMSCs were formed in the primary culture and contacted to each other at day 14. In the passage culture, the cells became bigger than those in the primary culture and a new generation was produced in 5—7 days. Under induction, levels of ALP were elevated and the morphological changes of osteoblast，phases of proliferation，aggregation，nodulation and mineralization were observed. During the mineralization, expression of OCN was detected. ConclusionBMSCs can be easily isolated and cultured in vitro, with strong proliferation ability and osteogenic capacity. BMSCs can be used as seed cells for tissue engineering of bone.

    ［KEY WORDS］mesenchymal stem cells； induction differentiation; cell culture; alkaline phosphatase; osteocalcin

    随着科学技术的不断发展，现在人们已逐渐认识到，骨髓非造血干细胞有一类来源于中胚层的未分化的间充质干细胞，又称为骨髓间充质干细胞（BMSCs），该细胞具有多向分化潜能，易于分离培养，体外增殖能力强，可进行自体移植而不存在组织配型和免疫排斥的问题等特点，目前发现其具有能够分化形成至少7种组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成肌细胞等组织细胞的潜能。为骨、软骨、肌肉等结缔组织的损伤修复提供了潜在的细胞来源，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。BMSCs的成骨定向诱导是骨组织工程种子细胞研究的关注焦点。本实验通过全骨髓培养法分离BMSCs,并用诱导分化培养液做定向诱导培养, 观察BMSCs向成骨细胞分化过程中的细胞形态学变化，进行成骨细胞生物学表型鉴定以探讨BMSCs的培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的条件。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  成年Wistar大鼠（SPF级）2只, 雌雄不限,体质量140～170 g, 由青岛市实验动物中心提供。

    1.1.2  试剂  低糖DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco），胰蛋白酶(Hyclone，Sigma)，胎牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)，β甘油磷酸钠(Sigma)，地塞米松(Sigma)，维生素C(Sigma)， 碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，逆转录试剂盒（PROMEGA），引物由上海生工公司合成。

    1.1.3  成骨诱导液  基础培养液（内含体积分数0.10胎牛血清+低糖DMEM+100 U/L 青霉素+100 U/L 链霉素+2 mmol/L谷氨酰胺），10 mmol/L 的β甘油磷酸钠，10-7 mol/L 地塞米松，50 mg/L维生素C。

    1.2  方法

    1.2.1  BMSCs的分离和培养  健康成年Wistar大鼠脱颈处死，体积分数0.75乙醇浸泡30 min，无菌条件下取股骨及胫骨，显露骨髓腔。用含体积分数0.10 FBS 的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔冲出骨髓，然后反复吹打制成骨髓单细胞悬液。将骨髓单细胞直接接种于培养瓶中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养。于48 h更换培养液，以后每3 d换液1 次，大约14 d BMSCs爬满培养瓶底，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶，以5 ×107 /L的密度接种于6 孔培养板, 诱导分化培养组(实验组)加入诱导分化培养液, 基础培养组(对照组)加入等量基础培养液, 每3 d换液1次。

    1.2.2  细胞观察  倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖、细胞形态的变化及钙盐沉积。

    1.2.3  CD34、CD45检测  第三代细胞BMSC消化,计数离心, 加入200 μL PBS重悬细胞, 加入荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的CD34、PC5标记的CD45一抗,固定,流式细胞仪检测。

    1.2.4  细胞矿化作用的检测  40 g/L的甲醛固定30 min,水洗，饱和茜素红染色30 min,观察细胞的形态和染色结果。

    1.2.5  碱性磷酸酶（ALP）活性测定  采用重氮盐法（改良Kaplow法）染色，可见胞浆有蓝染颗粒或块状沉淀，为ALP阳性反应。

    1.2.6  骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、骨粘连蛋白（ONN）的测定  将细胞接种于预先放有玻片的6 孔板内，于诱导的第12天时，用PBS 洗净孔内的培养液，加1 mL Trizol裂解细胞，抽提总RNA，按试剂盒的说明书进行操作。使用PROMEGA试剂盒进行RTPCR反应。PCR循环条件为：94 ℃，30 s;55 ℃，30 s；72 ℃，1.5 min，共35个循环。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶分析仪拍摄电泳结果。引物设计：①OCN：上游引物5′GTCCAGAGTCCAG CAAAG3′，下游引物5′TCCCAGCC ATTGATACAG3′;②OPN：上游引物5′TTGCTTTTG CCTCCTAGGCA3′，下游引物5′GTGAAAACTTCGGTTGCTGG3′；③ONN：上游引物5′TGGATCTTCTTTCTCCTTT3′，下游引物5′TTCTGCTTCTCAGTCAGA3′；④βactin：上游引物5′ATCATGTTTGAGACCTTCAA3′，下游引物5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′[1]。

    2  结    果

    2.1  倒置相差显微镜下所见

    2.1.1  细胞原代培养  BMSCs接种24 h后, 细胞贴壁, 72 h 后开始增殖，生长良好，呈集落样生长,细胞呈多突、梭形,核呈椭圆形, 核仁多而明显, 14 d 细胞密集在集落中心,周围细胞呈旋涡状或放射状排列,细胞之间无接触抑制,集落间出现重叠（图1）。

    2.1.2  细胞的传代培养  将原代培养的细胞使用2.5 g/L 胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液, 传代培养。传代细胞在24 h内贴壁, 较原代细胞体积大, 呈不规则的多角形,细胞核椭圆形或圆形,有多个核仁,胞浆中有黑色颗粒。传代细胞增殖较快,5～7 d左右达85%～90%融合。

    2.1.3  细胞的诱导分化培养  传代培养中细胞加入诱导分化培养液, 9 d后细胞长满培养皿底, 并开始密集重叠生长,无接触抑制。12～16 d出现了较多散在的致密圆形矿化结节,并逐渐增大,结节周围的细胞密度较高,轮廓不清,结节中心透光性差(图2)。此时,基础培养中作对照培养的细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。

    2.2  细胞表面抗原表达

    细胞表面抗原CD34、CD45的阳性率分别为7.31%、5.67%。

    2.3  细胞矿化作用

    实验组茜素红染色显示圆形矿化结节呈橘红色(图3)， 为茜素红与钙盐形成的橘红色复合物；对照组染色阴性。

    2.4  ALP活性

    未诱导BMSCs 的ALP 活性较弱，经成骨诱导后，细胞胞质中呈现蓝色颗粒或块状沉淀，为ALP 阳性反应部位（图4）。

    2.5  OCN、OPN、ONN mRNA的表达

    3  讨    论

    许多研究表明，BMSCs易于获取，可诱导分化为多种细胞，并且易于被外源基因转染并稳定表达，在组织工程细胞替代治疗中有极其广泛的应用前景。但人体BMSCs含量稀少，仅占单核细胞的百万分之一到十万分之一[3]。而组织工程需要大量的种子细胞，因此进行分离纯化和体外扩增就显得尤为重要。目前用于分离纯化BMSCs的方法主要有4种：全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。流式细胞仪分离法与免疫磁珠法操作繁琐、费用昂贵，并且对细胞活性影响较大。所以全骨髓贴壁培养法与密度梯度离心法更为常用。本实验采用全骨髓培养法，将BMSCs直接加入培养瓶中，而未先进行分离。由于BMSCs 贴壁生长，而造血细胞悬浮生长，尽管有较多造血细胞沉淀于培养瓶底部，但早期连续震荡换液后，能基本去除未贴壁细胞。该培养方法省略了BMSCs 分离步骤，减少污染机会和细胞丢失。第三代细胞流式细胞仪检测造血系细胞标志CD34 和白细胞所共有的CD45[4]均为阴性结果，一方面提示全骨髓培养法在细胞培养中可以获得较纯的细胞；另一方面提示所培养的主要细胞是骨髓细胞中数量很少但贴壁能力很强的细胞；再者从形态学以及诱导分化后具有的成骨活性表现，间接证明所培养的细胞就是BMSCs。

    MCQILLAN等[6]报道,β甘油磷酸钠可以为骨细胞分化和增殖提供磷原子,能增加碱性磷酸酶在成骨细胞中的表达,从而促进生理性钙盐的沉积,促进钙化。β甘油磷酸钠可诱导BMSCs向成骨细胞方向分化,为分化中的成骨细胞的成骨活动提供磷酸根,促进生理性钙盐沉积; 地塞米松能提高碱性磷酸酶活性,诱导细胞表达骨钙素,增加Ⅰ型胶原和骨桥素信使核糖核酸的合成,诱导BMSCs向成骨细胞转化;维生素C促进体外培养细胞合成胶原,并调节碱性磷酸酶活性。

    ALP明显阳性表达是BMSCs向成骨细胞分化的重要标志[7]。本文从培养的第2周ALP 染色即出现阳性反应,随培养时间延长反应逐渐增强，染色后可见大部分诱导细胞的胞浆被染成深蓝色。在成骨细胞表型形成过程中，OCN 的表达呈现发育阶段特异性，在细胞结节形成时开始表达，基质矿化时达到最高水平[8]（茜素红染色阳性可以证明）。OCN、OPN、ONN均属于比较重要的非胶原蛋白，在骨钙化过程中起着重要的作用,ALP 虽然未被包括在骨基质蛋白之内,但它不仅是成骨细胞分化系列中的最重要标记,也是参与骨钙化的重要蛋白之一。成骨细胞可通过基质小泡释放钙离子和ALP 等物质,钙离子在ALP 作用下沉积在胶原上,完成基质矿化过程[9]。在成骨细胞分化过程中,ALP和OPN相继表达,而骨钙素的表达始于骨钙化开始后。本实验采用β甘油磷酸钠、Vit C和地塞米松作为成骨诱导添加剂,诱导的细胞能够产生ALP,并具有矿化能力,OCN、OPN、ONN的mRNA阳性表达证明我们诱导分化后的BMSCs具备成骨细胞的生物学特性。

    综上所述，大鼠的BMSCs在体外培养中增殖能力强,经体外诱导和分化的成骨细胞生长良好,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,且周期短、重复性好,在骨组织工程中有良好的应用前景，为临床开展自体成骨细胞修复骨缺损奠定了基础。

【参考文献】
  ［1］曹谊林，刘伟，崔磊，等. 组织工程学理论与实践［M］. 上海：上海科学技术出版社， 2004：166170.

［2］叶发刚，夏长所，张卫兵，等. 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定［J］. 青岛大学医学院学报， 2006，42（4）：330332.

［3］BARRY F P, MURPHY J M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(4):568584.

［4］柴岗，张艳，曹谊林，等. 人骨髓基质细胞表面标志的研究[J]. 组织工程与重建外科杂志， 2005，1（5）：263265.

［5］LYNCH M P， STEIN J L， STEIN G S, et al. The influence of type Ⅰ collagen on the development and maintenance of the osteoblast phenotype in primary and passaged rat calvarial osteoblasts: modification of expression of genes supporting cell growth，adhesion，and extracellular matrix mineralization［J］. Exp Cell Res， 1995，216(1):3545.

［6］　MCQILLAN D J, RICHARDSON M D, BATEMAN J F. Matrix deposition by a calcifying human osteogenic sarcoma cell line (SAOS22) ［J］. Bone, 1995,16:415426.

［7］ABDALLAH B M， JENSEN C H， GUTIERREZ G， et al. Regulation of human skeletal stem cells differentiation by Dlk1/Pref1 ［J］. J Bone Miner Res， 2004，19(5):841852.

［8］STEIN G S, LIAN J B. Molecular mechanisms mediating proliferation/differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype［J］. Endocr Rev， 1993，14(4):424442.

［9］王永红,王常勇,郭希民,等. 人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究［J］. 中国生物医学工程学报, 2002,21(35):251255.

作者单位：（青岛大学医学院附属医院口腔科, 山东 青岛 266003）