肾性高血压大鼠靶器官细胞凋亡及四逆汤的干预作用

【摘要】  目的 研究实验性肾动脉狭窄性高血压大鼠主要靶器官的细胞凋亡状况以及四逆汤对细胞凋亡的干预作用。方法 健康雌性Wistar大鼠24只，随机分为正常对照组、肾性高血压组和四逆汤治疗组，每组8只。双肾动脉夹闭法建立肾性高血压动物模型。采用TUNEL法检测心脏和肾脏组织的细胞凋亡水平。结果 肾性高血压组大鼠心、肾阳性细胞计数均显著高于正常对照组及四逆汤治疗组（F=228.24、171.75，q=16.26～29.03，P<0.01），四逆汤治疗组阳性细胞计数与正常对照组相比较差异仍有显著意义（q=7.26、9.68，P<0.01）。结论肾性高血压大鼠心、肾细胞凋亡增多，四逆汤对细胞凋亡有一定的抑制作用。

【关键词】  四逆汤 高血压 肾性 细胞凋亡 大鼠

    APOPTOSIS IN RENAL HYPERTENSIVE RATS AND THE INTERVENTIONAL EFFECTS OF SINITANGLIU HAIXIA, YANG XUEWEI, CHONG ZHUO, et al (Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate apoptosis of the target organs  of experimental hypertensive rats caused by renal artery stenosis and the interventional effects of Sinitang on the apoptosis. MethodsTwentyfour female healthy Wistar rats were evenly divided into normal control group, renal hypertensive group, and Sinitangtreated group. The hypertensive model was established by clipping the renal arteries. Sinitang was given to the hypertensive rats and Sinitangtreated rats. The apoptosis of renal and heart tissues of the rat were detected by terminal deoxynucleotidy1 transferasemediated dutpbiotin nick end labeling (TUNEL) .ResultsThe positive cell counting in renal and heart tissues of the rat in hypertensive group was significantly higher than that in the control and Sinitang groups (F=228.24,171.75;q=16.26-29.03;P<0.01), the difference of positive cell counting between Sinitangtreated and normal control groups was also significant （q=7.26,9.68;P<0.01）. ConclusionApoptosis in the kidney and heart of renal hypertensive rats increases, and Sinitang might inhibit their apoptosis.

    ［KEY WORDS］ Sinitang; hypertension, renal; apoptosis; rats

    研究高血压靶器官损害，探讨其发病机制，对防治高血压所带来的危害具有一定临床意义。细胞凋亡是机体自主性调节的一种生理机制，是一些特殊基因激活内源性DNA内切酶,引起细胞死亡［1］。对多细胞器官而言，其自身稳定需要生长与凋亡相平衡，细胞增生大于凋亡，则组织器官增生肥厚；反之则萎缩［2］。高血压主要的特征之一是靶器官平滑肌细胞肥大增生，增生的同时也出现细胞凋亡，如高血压靶器官存在的重构现象，是由于增生和凋亡两种途径的共同刺激所造成的大量细胞生长和细胞死亡的一种新平衡［2］。本研究应用肾性高血压动物模型，观察高血压对靶器官心脏和肾脏的细胞凋亡的影响，同时应用中药四逆汤进行干预，以观察四逆汤对高血压大鼠主要靶器官细胞凋亡的影响。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物分组

    成年健康雌性Wistar大鼠24只，3月龄，体质量为180～200 g，SPF级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20030010，22 ℃室温下常规喂养。随机分为正常对照组、肾性高血压组和四逆汤治疗组，每组8只。

    1.2  建立动物模型

    根据双肾动脉夹闭法建立肾动脉狭窄性高血压动物模型［3］，应用RBF2型大鼠尾动脉血压计（北京中日友好医院临床医学研究所研制）反复测量3次，取均值，以血压大于17.29 kPa为模型成功的标志，不成功的动物及术中出血量过多、手术操作时间超过30 min、术后2 h仍不苏醒以及状态不好的大鼠，予以剔除，另选大鼠补齐。正常对照组大鼠不做任何处理。

    1.3  治疗方案

    四逆汤提取物由北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室提供，实验动物全方给药（附子5 g，干姜4.5 g，甘草6.0 g，合计15.5 g），每千克0.04剂，合提取物155 mg/kg。用蒸馏水将提取物配制成20 g/L水溶液。动物模型成功后，四逆汤治疗组大鼠按7.75 mL/kg灌胃，每日1次，连用14 d，肾性高血压组大鼠同步给予等量的生理盐水，正常对照组不做处理。

    1.4  标本采集和处理

    治疗结束后，麻醉大鼠，仰卧固定，打开腹腔，依次经腹主动脉灌注生理盐水200 mL、40 g/L多聚甲醛和0.1 mol/L PBS混合液300 mL固定，迅速取心和肾，置于40 g/L多聚甲醛和0.1 mol/L PBS混合液300 mL内固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，置体积分数0.70的乙醇中保存备用。常规脱水、透明、浸蜡、包埋。肾脏沿长轴纵向切片，心脏垂直于长轴沿横切面切片，厚度7 μm，每隔10张抽取一张，贴于经多聚赖氨酸处理的切片上，室温保存备用。

    1.5  细胞凋亡检测

    TUNEL细胞凋亡检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。标本切片常规脱蜡、水化，按试剂盒提供实验步骤进行操作，DAB显色，光镜下观察，以核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下（400倍）在心和肾组织切片上，随机各取10个视野计数阳性细胞，以±s表示。

    2  结    果

    心脏内凋亡阳性细胞主要见于心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞；肾脏内凋亡阳性细胞主要见于肾小管上皮细胞和肾小球血管内皮细胞。肾性高血压组与正常对照组相比较，心脏和肾脏组织中凋亡阳性细胞数明显增多，差异有极显著意义（F=228.24、171.75，q=29.03、25.93，P<0.01），四逆汤治疗组阳性细胞数比肾性高血压组显著降低（q=21.77、16.26，P<0.01），但仍明显高于正常对照组（q=7.26、9.68，P<0.01）。见表1。

    表1  心脏和肾脏靶器官细胞凋亡的比较（±s）

    组  别n心脏肾脏正常对照组82.30±0.652.60±0.84肾性高血压组823.10±3.1729.40±3.50四逆汤治疗组87.50±1.3612.60±3.56

    3  讨    论

    高血压早期仅表现为心排血量增加和全身小动脉张力的增加，并无明显病理学改变。高血压持续及进展即可引起全身小动脉病变，表现为小动脉玻璃样变、中层平滑肌细胞增殖、管壁增厚、管腔狭窄（即血管壁“重构”），使高血压维持和发展并进而导致重要靶器官如心、脑、肾缺血损伤。国内外资料显示，高血压病人血管及其主要靶器官（心、脑、肾）中均存在细胞凋亡现象，推测细胞凋亡可能在高血压心血管重塑中起重要作用［2］。

    心脏是高血压主要的靶器官之一，心脏重塑与细胞凋亡及左心室纤维化有关。由于成熟的心肌细胞属终末分化细胞，无再生能力，不能进行有丝分裂。因此，心肌肥厚的形成主要是心肌体积的肥大，而非数量的增加。故心肌细胞的凋亡将导致细胞数量的减少，不可避免造成心肌收缩成分的丧失。临床和实验研究结果均表明，单个心肌细胞凋亡后心肌瘢痕形成，即所谓心脏间质纤维化，纤维化的增加又使左心室的顺应性下降；另一方面，心肌内血管内皮细胞凋亡造成心肌内微细血管网减少，供血功能降低，进一步使心功能恶化并促进心肌细胞凋亡的发生，从而形成恶性循环［4，5］。

    细胞凋亡在调节各组织结构功能上起着非常重要的作用，它与细胞增生一起共同调节组织细胞总量平衡。现已证明，高血压靶器官细胞凋亡是一种由基因控制的主动细胞死亡方式，与bcl2、Fas、p53、cmyc等基因有关［6］。高血压可能作为一种触发因素，激活凋亡基因表达，从而诱导或抑制细胞凋亡，参与高血压所致的靶器官损害［7］。

    肾素血管紧张素系统（RAS）能够促进细胞凋亡增加。人工注射血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）可致肾脏细胞凋亡增加，致使高血压状态下肾脏增生细胞减少［8］。目前认为，在血压升高背景下RAS的激活，在调节细胞增生和凋亡的平衡中起重要作用。

    研究表明，细胞凋亡是高血压心血管重构中重要的病理生理机制之一。通过干预细胞凋亡而逆转高血压的心血管重塑成为防治高血压及其并发症的新的研究目标。四逆汤是经典医著《伤寒论》记载的具有温肾回阳作用的主方，在本实验中证实，其具有抑制肾性高血压动物细胞凋亡的作用，其机制可能为调节机体内多种凋亡刺激因子的含量，如ATⅡ、iNOS、TNF等［9］。同时，它具有抗氧化损伤作用，能够清除低氧状态下产生的自由基［10］。另外，它能够改善低氧组织的能量代谢，对低氧组织有一定的保护作用［11］。这些综合因素使细胞凋亡减少，但其具体的机制还需进一步研究和探讨。

【参考文献】
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［3］郭云良,姚维成,高焕民,等. 神经生物学技术［M］. 青岛:中国海洋大学出版社, 2005:2022.

［4］OLIVETTI G, MELISSARI M. Myocyte cellular hypertrophy is responsible for ventricular remodeling in the hypertrophied heart of middle aged individuals in the absence of cardiac failure［J］. Cardiovasc Res， 1994,28(8):11991208.

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［7］徐岩，赵震霄，赵秀珍. 高血压肾病与肾性高血压胰岛素抵抗的临床研究［J］. 青岛大学医学院学报, 2001,37(4):315317.

［8］AIZAWA T, ISHIZAKA N, KURUKAWA K, et al. Different effects of angiotensin Ⅱ and catecholamine on renal cell apoptosis and proliferation in rats［J］. Kidney Int, 2001,59(2):645653.

［9］李守文,李晶,刘晓红,等. 四逆汤对失血性家兔肿瘤坏死因子的影响［J］. 黑龙江医药, 2002,25(6):1920.

［10］李守文,李晶,刘晓红. 四逆汤对失血性休克家兔氧化损伤的影响［J］. 黑龙江医药, 2003,26(1):1012.

［11］吴伟康,何光耀,罗汉川,等. 四逆汤与缺血心肌的能量代谢［J］. 中国中医基础医学杂志, 1996,2(2):2629.

作者单位：青岛大学医学院,山东 青岛 266021