头孢曲松钠对菌血症小鼠肠道膜菌群的影响

【摘要】  目的 观察静脉注射头孢曲松钠对小鼠肠道菌群的影响。方法 小鼠随机分为空白对照组（A组）30只、菌血症组（B组）48只及菌血症+抗生素组（C组）48只。B、C组制作菌血症模型24 h后, C组小鼠尾静脉注射头孢曲松钠100 mg/(kg·d)。在实验第4、11及18天，对各组小鼠结肠与回肠肠黏膜肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌进行定量分析，并取小鼠肝脏、脾脏、肾脏、血液做细菌培养。结果 A、B两组小鼠肠道各菌群比较，差异无显著性（F=2.826，P>0.05）。C组小鼠静脉注射头孢曲松钠4 d，其肠道各菌群的数量与A、B组比较，差异均无显著性（F=1.663～2.093，P>0.05）。C组小鼠用药11 d与A、B组比较，除肠球菌外其他菌群数量均有所减少，差异均有显著意义（F=3.501～22.563，q=2.617～9.441，P<0.05、 0.01）；用药18 d肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌数量较A、B组减少，差异均有显著意义（F=4.166～29.865，q=2.617～9.441，P<0.05、0.01）。小鼠用药18 d时发生肝脏、脾脏、肾脏、血液细菌易位，易位细菌主要是肠球菌与凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌。结论 长时间应用头孢曲松钠可造成小鼠肠道微生态的明显紊乱，导致细菌易位。

【关键词】  肠 头孢曲松 菌血症 细菌 小鼠

    EFFECT OF CEFTRIAXONE ON INTESTINAL FLORA OF BACTEREMIC MICELUAN NA, SUN YUNBO, DUAN FENG(Intensive Care Unit, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effect of intravenous ceftriaxone on intestinal microbial population and their translocation in mice.MethodsThe male mice were randomly divided into control group (group A, n=30), bacteremia group (group B, n=48), and bacteremia+ceftriaxone group (group C, n=48). Septicemia models were made in groups B and C. The mice in group C were given ceftriaxone 100 mg/(kg·d) intravenously 24 hours later. On 4th, 11th and 18th experiment day, intestinal bacteria, i.e. enteric bacilli, enterococci, Bacillus bifidus, and Bacillus acidi lactici, on colonic and ileac mucosa of the mice were analized quantitatively and their content in liver, spleen, kidney and blood was determined.ResultsThere was no significant difference in the amount of the above intestinal bacteria between groups A and B (F=2.826，P>0.05）. No significant difference in the amount of the bacteria between the mice given ceftriaxone for 4 days and those in groups A or B as well (F=1.663～2.093，P>0.05). After administration of ceftriaxone for 11 days, the difference of the amount of the bacteria between group C and group A or B was significant, except enterococci (F=3.501～22.563;P<0.01,0.05). After administration of ceftriaxone for 18 days, bacterial translocations appeared in liver, spleen, kidney and blood. The difference in the amount of the bacteria between group C, and group A or B was significant （F=5.658～29.865，P<0.01）.ConclusionLong duration intravenous ceftriaxone can cause obvious changes of intestinal ecology and bacterial translocation.

    ［KEY WORDS］intestines; ceftriaxone; bacteremia; bacteria; mice

    目前肠源性感染已成为医院内感染的主要来源，其病死率超过30%，其中以抗生素长期大剂量应用造成菌群失调而引起的肠源性感染尤为突出[1]。关于抗生素对肠道菌群的影响，头孢类抗生素的相关报道最多。肠道正常菌群与肠黏膜形成稳定的膜菌群，这是生物屏障的物质基础，也是构成定植抗力的重要因素之一。膜菌群不同于肠内容物菌群，不受食物类型、肠蠕动速度等影响，处于相对稳定、动态变化的生态平衡中[2]。本文旨在观察头孢曲松钠对菌血症小鼠肠道膜菌群的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  动物及分组  选择普通级纯系雄性昆明小鼠126只，体质量18～25 g，饲养在普通级动物设施内，颗粒饲料用微波炉加热消毒处理，饮水经高压灭菌处理，均自由摄取。实验动物和颗粒饲料均购于青岛市实验动物与动物实验中心。小鼠购后统一喂养颗粒饲料1周，以使肠道菌均一化并适应环境。随机分为空白对照组（A组）、菌血症组（B组）、菌血症+抗生素组（C组）。

    1.1.2  药物  头孢曲松钠（商品名为罗氏芬），由上海罗氏制药有限公司出品，每瓶1.0 g，批号：SHOD6505,青岛大学医学院附属医院药剂科提供。1.1.3  实验用菌  ATCC27853型铜绿假单胞菌标准株，购于北京药品生物制品检定所。

    1.1.4  培养基  麦康凯琼脂培养基（MAC），肠球菌选择性培养基（EC），乳酸杆菌选择性培养基（LBS），双歧杆菌选择性培养基（BS）及脱纤维羊血血平板。

    1.2  实验方法

    1.2.1  菌血症模型的制备[4,5]  绿脓杆菌标准株用无菌生理盐水稀释并接种于血平板上，37 ℃培养24 h。然后转种于2 mL普通肉汤管内,37 ℃培养6 h。加无菌生理盐水稀释至浓度为1.5×1011/L，即为感染小鼠所需的终浓度，现配现用。小鼠造模前禁食8 h，自由饮水。B组及C组小鼠尾静脉注射绿脓杆菌菌液0.1 mL造模，A组小鼠注射生理盐水 0.1 mL。

    1.2.2  给药方法  C组小鼠在造模后24 h开始给予尾静脉注射头孢曲松钠100 mg/kg[6]，每日1次。A、B组不给药。各组小鼠分别于给药4、11、18 d后处死。期间所有小鼠自由摄取颗粒饲料和饮水。

    1.3  检测指标及方法

    1.3.1  肠道膜菌群  无菌棉拭子擦拭内脏组织做细菌培养。在距回盲部5 cm处取约2 cm回肠，在距回盲部4 cm处取约2 cm结肠，用无菌剪纵行剖开，在通入体积分数0.999 9高纯氮的生理盐水中漂洗3次，至漂洗液澄清。无菌滤纸吸干残液，称质量，匀浆后加入0.5 mL生理盐水，以10倍系列稀释的方法稀释到10-5。各稀释液用微量加样器取25 μL接种到MAC、EC、LBS、BS及脱纤维羊血血平板，以L棒涂布均匀后培养。MAC与EC平板置于37 ℃温箱中，需氧培养24 h；BS、LBS置于厌氧箱中，37 ℃厌氧培养48 h。对各培养基上生长的菌落进行革兰染色镜检、耐氧试验、微量生化反应试验，以鉴定细菌类型，选择菌落数适中的稀释度，计算出同一稀释度平均菌落数（X)。按文献[3]公式计算细菌含量。每克组织菌落数=X×[稀释液量(mL)+标本质量(g)]×稀释倍数/标本质量（g）。

    1.3.2  细菌脏器易位  无菌分离摘除小鼠的肝脏、脾脏、肾脏，称质量后用无菌组织研磨器研碎加入0.5 mL生理盐水，将组织匀浆、眼球血和腹腔拭子分别涂到血平板与MAC平板，置于37 ℃温箱中，需氧培养24 h，计数菌落数(CFU)，涂片行革兰染色镜检和生化鉴定。腹腔棉拭子培养用于判断无菌操作质量。凡组织匀浆和血液中培养出3个或3个以上菌落即为细菌易位阳性，计算出每克组织中易位细菌数。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 14.0统计分析软件处理，结果以均数±标准差表示，数据间比较采用单因素方差分析。

    2  结    果

    2.1  肠道各菌群数量

    A组小鼠实验第4、11、18天肠道各菌群数量比较，差异无显著性（F=1.277，P>0.05）。B组与A组小鼠实验第4、11、18天肠道各菌群数量比较，差异也无显著性（F=2.826，P>0.05）。C组小鼠用药4 d，结肠与回肠各菌群的数量与A、B组比较，差异无显著性（F=1.663～2.093,P>0.05)。C组小鼠用药11 d结肠与回肠肠杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌数量较A、B组减少，差异有显著性（F=3.501～22.563，q=2.617～9.441，P<0.05、 0.01）。C组小鼠用药18 d结肠与回肠肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量与A、B组比较，差异均有显著意义（F=4.166～29.865，q=2.617～9.441，P<0.05、0.01）。随用药时间的延长，小鼠肠道菌群失调更加严重。C组小鼠用药11 d回肠乳酸杆菌与双歧杆菌较用药4 d时有所减少（F=3.963、2.017，q=3.751～2.617，P<0.05）；用药18 d与4 d相比较，除肠球菌外其他各菌群数量均减少（F=4.613～28.156，q=3.617～13.426，P<0.01）。见表1。

    2.2  细菌易位情况

    正常组小鼠各脏器组织及血液中均未培养出细菌；B组及C组小鼠用药4、11 d时，其各脏器组织及血液中仅培养出绿脓杆菌。C组小鼠用药18 d时出现细菌易位，肝脏的细菌易位率为80%，脾脏、肾脏均为60%，血液为10%。生化鉴定示易位细菌主要为凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌及肠球菌。

    3  讨    论

    许多因素可以破坏胃肠道的正常菌群，包括抗生素的应用、生理或心理应激、辐射及胃肠蠕动的改变、饮食的改变等。其中抗生素的应用是引起胃肠道微生态失调最常见、最重要的因素。

    抗菌药物对胃肠道菌群影响与否及影响的程度与抗生素的抗菌谱、用药时间长短、用药剂量、给药途径、药物代谢动力学特性等因素有关。头孢曲松钠属广谱的第三代头孢菌素，对革兰阴性、革兰阳性需氧菌(肠杆菌、肠球菌)，革兰阳性厌氧菌(乳酸杆菌、双歧杆菌)及部分革兰阴性厌氧菌均有较强杀菌表1  小鼠肠道各菌群数量作用。资料显示，健康志愿者口服头孢曲松钠1 d，粪便中的肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量即出现减少，肠球菌无明显变化；应用头孢曲松钠4 d，粪便中的肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量明显减少，肠球菌、白色念珠菌数量轻度增加；应用头孢曲松钠7 d，以上变化更加明显[8]。本文结果显示，注射头孢曲松钠4 d时小鼠肠道菌数量与A、B组比较均无差异；用药11 d时C组小鼠结肠与回肠肠杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌较A、B组明显减少；用药18 d时以上指标变化更加明显，肠球菌的数量继续增多。应用头孢曲松钠后小鼠肠黏膜上的肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌与文献报道这4种细菌的数量变化趋势是一致的[8]。而且随用药时间的增加，对头孢曲松钠敏感的细菌（肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌）数量减少越明显；而对头孢曲松钠相对不敏感的条件致病菌（肠球菌）增殖愈加明显。即用药时间越长，小鼠肠道菌群失调越严重。

    肠道内正常共生厌氧菌可产生短链脂肪酸，是结肠上皮细胞的重要能量合成底物和呼吸燃料。如果肠道内的正常共生厌氧菌减少，则可能导致结肠上皮细胞功能发生障碍，容易发生细菌易位。KATOULI等[9]研究证实，肠道菌群失调、双歧杆菌和乳酸杆菌数量减少，是严重烧创伤后肠源性易位的重要原因。有实验证明,给动物口服抗生素,破坏其微生态环境,再大量植入耐药菌造成菌群失调, 虽然肠黏膜没有明显的病理缺损,但存在的炎性水肿会使肠壁通透性增高,在应激状态下,细菌则会发生易位。在本实验中，小鼠用药18 d时肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的数量明显减少，肠道菌群严重失调，小鼠发生脏器的细菌易位。此时在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、血液中有革兰阳性球菌易位，经鉴定主要为肠球菌和凝固酶阴性金黄色葡萄球菌。

    综上所述，长期应用头孢曲松钠可引起小鼠肠道菌群失调，使具有很强的生理作用的双歧杆菌、乳酸杆菌数量减少。肠杆菌科细菌数量明显减少，降低了机体对感染的定植抗力，使那些原来被正常菌群屏障所抑制的内源性病原菌——肠球菌得以大量的繁殖，造成感染。本研究提示，临床上应尽量缩短抗生素的应用时间，以减轻肠道菌群失调的程度。

【参考文献】
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[3]祝小枫,熊德鑫. 介绍几种细菌定量方法在微生态研究中的应用[J]. 中国微生态学杂志, 1995,7(5):4546.

[4]孟林,刘春波. 铜绿假单胞菌外毒素A对小鼠脾淋巴细胞的作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2003，39(1):3555.

[5]TETSUYA M, KAZUHIRO T, SHUICHI MI. Imunomodulating effect of fosfomycin on gutderived sepsis caused by pseudomonas aeruginosa in mice antimicrobial [J]. Agents Chemotherapy, 1997,41(1):308313.

[6]马东梅,董增义,张绍燕,等. 假单胞菌对12种抗生素最低抑菌浓度的检测[J]. 齐鲁医学杂志， 2005，20（2）：68.

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[9]KATOULI M, BARK T, LJUNGQVIST O, et al. Composition and diversity of intestinal coliforill flora influence bacterial translocation in rats after hemorrhagic stress[J]. Infect Immun, 1994,62:768774.

作者单位：青岛大学医学院附属医院ICU，山东 青岛 266003