高能X线照射对肺癌转移相关基因的影响

【摘要】  探讨高能X线照射对肺癌转移相关基因的影响。方法 建立Lewis肺癌模型，将荷Lewis肺癌的C57BL/6 雄性小鼠35只随机分为照射组（n=18）和对照组（n=17），照射组接受30 Gy的X线肿瘤局部照射，对照组不接受照射，2周后采用免疫组化法检测瘤组织中E钙黏素(ECad)蛋白和基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白的表达。结果 与对照组比较，照射组MMP9蛋白表达水平显著降低，ECad蛋白表达水平显著升高，差异均有显著性(t=9.53、20.68,P<0.01)。结论 X线照射可能通过抑制肿瘤组织内MMP9蛋白表达和促进ECad蛋白表达阻止肿瘤细胞的侵袭和转移。

【关键词】  放射疗法 高能 肺肿瘤

　　THE EFFECT OF XRAY IRRADIATION ON THE GENE EXPRESSIONS OF ECADHERIN AND MMP9 IN LUNG CANCER

　　LIU XIGUANG, YU HONGE, SONG TINGTING
　　(Tumor Centre, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the effects of Xray irradiation on  gene expressions of Ecadherin and MMP9.MethodsSolidtumorbearing mice were produced with Lewis lung cell (LLC) and randomly divided into radiation group (n=18) and control group (n=17). The mice in the radiation group were irradiated by 30 Gy Xray. The expressions of Ecadherin and MMP9 were detected by immunohistochemical.ResultsAfter two weeks of therapy. Result  The expressions of Ecadherin and MMP9 in the radiation group were higher and lower than that in the control, respectively (t=20.68,9.53;P<0.01). ConclusionXray irradiation may increase Ecadherin expression and inhibit MMP9 expression,  prohibit the invasion and metastasis of tumor cells.
   
　　［KEY WORDS］Radiotherapy, highenergy; Lung neoplasms; Neoplasms metastasis; Cadherin; Matrix metalloproteinases9

    肺癌的发生率和病死率皆位于恶性肿瘤的前3位，且发现时大约2/3的病人已失去手术机会，因此放射疗法已成为肺癌的主要治疗手段。侵袭与转移是导致肿瘤病人死亡的主要原因[1]。细胞外基质(ECM) 的降解被认为是肺癌侵袭正常组织和开始转移的信号及重要途径。基质金属蛋白酶(MMPs)几乎能降解ECM 的所有成分，促进癌细胞对周围正常组织的侵袭，导致肿瘤的扩散和转移。上皮钙黏素(ECad) 是维持上皮细胞形态及同种细胞间黏附连接的重要黏附分子。实验研究已证实ECad 基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，它可能通过促进同型细胞之间的黏附，使癌细胞之间保持密切接触，从而减少癌细胞脱离原发灶向远处转移的机会[2,3]。目前放射治疗对MMP9和ECad的影响尚不十分清楚。本实验旨在探讨X线照射对Lewis肺癌小鼠MMP9及ECad表达的影响，为放射治疗在临床上的应用提供更多的理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    Lewis肺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究所。实验动物为雄性C57BL近交系小鼠，SPF级，6～8周龄，体质量18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，置于我院SPF级动物室饲养。MMP9及ECad免疫组化检测试剂盒、兔抗鼠MMP9多克隆抗体、兔抗鼠ECad均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型的制备及分组 

　　体外培养生长活跃的Lewis肺癌细胞经胰酶消化、收集并离心，用PBS配成2×1010/L的单细胞悬液，取0.2 mL接种于C57BL小鼠左腹股沟区皮下，SPF环境下饲养，1周后成瘤，瘤径约5～7 mm，制成荷瘤小鼠。随机分成两组，实验组（n=18）接受6 MV的X线肿瘤局部照射，对照组（n=17）不接受X线照射。

　　1.2.2  照射方法 

　　将实验组小鼠用100 g/L水合氯醛（350 mg/kg）经腹腔麻醉后，用胶布固定在板上，用记号笔标出小鼠肿瘤体表定位，在瘤体上放1 cm厚凡士林纱布补偿，用美国Varian 23 EX408高能直线加速器产生6 MV的X线垂直照射靶区，源皮距（SSD）为100 cm，剂量率为6 Gy/min，照射野为2.0 cm×2.0 cm，总照射剂量30 Gy。照射后2周处死小鼠，取出肿瘤组织。

　　1.2.3  MMP9及ECad表达检测 

　　用免疫组织化学PV6001二步法。将肿瘤组织块用100 g/L 中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明,石蜡包埋后连续切片。切片经脱蜡水化后在体积分数0.03过氧化氢溶液中浸泡10 min，PBS冲洗。加枸橼酸缓冲液，微波抗原修复20 min，加兔抗鼠多克隆抗体（抗体稀释比例均为1∶50）,同时用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，室温孵育2 h。然后滴加通用型IgG抗体（Fab段）HRP多聚体，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，应用DAB显色，苏木精复染，脱水，中性树胶封片。MMP9阳性细胞表现为细胞浆内有棕黄色颗粒沉淀，ECad阳性细胞表现为细胞膜上有棕黄色颗粒。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，计算阳性细胞占细胞总数的比率。

　　2  结 果

    对照组MMP9表达阳性率为0.703±0.114，照射组为0.318±0.055，两组比较，差异有显著性（t=9.53,P<0.01)。对照组ECad表达阳性率为0.276±0.038，照射组为0.664±0.045，两组之间差异有显著性(t=20.68,P<0.01)。

　　3  讨 论

    由于肺癌的早期发现率低,临床上多数病人就诊时病情已属中晚期，总治愈率不超过10%[4]。浸润和转移是癌症致死的主要原因，癌症病人因远处转移而死亡者占2/3以上[5]。大量临床研究结果证明，ECad和MMP9与肺癌的淋巴结转移及远处转移有着密切的关系[6]，因此可以通过调节ECad及MMP9的表达而达到抗肿瘤转移的目的。

    细胞黏附和基质降解是肿瘤转移中的两个重要环节[7]。肿瘤细胞黏附其他肿瘤细胞、宿主细胞或细胞外基质成分的能力影响其侵袭和转移。钙黏蛋白是一组Ca2+依赖性跨膜糖蛋白，介导同种细胞分子间的黏附。相邻细胞间ECad 胞外区交错排列形成反向平行二聚体，称为“拉链”式结构，使相邻同种上皮细胞紧密黏附在一起，胞浆区通过连环素与细胞骨架相连，从而正常发挥ECad 的功能。肿瘤细胞ECad的表达降低，细胞的黏附性降低，瘤细胞易从瘤体上脱落下来，使肿瘤具有侵袭转移性[8]。本文结果显示，与对照组相比比较，照射组小鼠癌细胞ECad 的表达增高，差别有显著性。MMPs是一类Zn2+依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解ECM的所有成分。ECM的降解是继瘤细胞与基质黏附后发生的重要变化，也是肿瘤细胞迁移、浸润基质的前提。大量实验证明，癌细胞侵袭转移能力与其产生或诱导产生的降解ECM的蛋白酶密切相关；而非侵袭转移性癌细胞或正常细胞则不能穿过这些屏障[9]。MMP9是一种重要的MMP蛋白，MMP9表达增多或活性增强参与了肿瘤的侵袭和转移。本文结果表明，X线照射肿瘤可以明显降低小鼠癌细胞MMP9的表达。

    综上所述，X线照射可能通过增高瘤细胞的ECad表达，加强瘤细胞间的黏附,避免瘤细胞从原发灶脱落；并抑制MMP9表达，减少其对细胞外基质的降解,从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。本文结果为放射治疗在临床上应用提供了理论基础。

【参考文献】
  　　[1]STEEG P S. Metastasis suppressors alter the signal transduction of cancer cells[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(1):5563.

　　[2]SALON C, MORO D, LANTUEJOUL S, et al. Ecadherinbetacatenin adhesion complex in neuroendocrine tumors of the lung: a suggested role upon local invasion and metastasis[J]. Hum Pathol, 2004,35(7):11481155.

　　[3]金卫中,金翔凤,张永红,等. 上皮型钙黏蛋白在原发性胃癌中的表达及其意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(4):448449.

　　[4]KOPPER L,TIMAR J. Genomics of lung cancer may change diagnosis, prognosis and therapy[J]. Pathol Oncol Res, 2005,11(1):510.

　　[5]徐叔云. 药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社, 2002:17571823.

　　[6]CHARALABOULOS K, GOGALI A, KOSTOULA O K, et al. Cadherin superfamily of adhesion molecules in primary lung cancer[J]. Exp Oncol, 2004,26(4):256260.

　　[7]FIDLERI J. The pathogenesis of cancer metastasis: the seed and soil hypothesis revisited [J]. Nature Rev Cancer, 2003,3(6):453458.

　　[8]DICROCE L, PELICCI P G. Tumourassociated hypermethylation: silencing Ecadherin expression enhances invasion and metastasis[J]. Eur J Cancer, 2003,39(4):413414.

　

作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤中心,山东 青岛 266003;