无精子因子及其临床检测的研究进展

【关键词】  少精子症；染色体,人,Y；变异(遗传学)；综述

　　无精子因子（AZF）是位于Y染色体长臂、与精子发生相关的一组基因或基因簇。AZF在无精子症和严重少精子症的病人中热点缺失，缺失率占不育男性的8.2%[1]。近年来，随着分子遗传学和辅助生殖技术的不断发展，AZF微缺失的检测日益受到重视，在男性不育的诊断和治疗中具有非常重要的意义。

　　1  Y染色体的结构与分区

    Y染色体是一种近端着丝粒染色体，由两条染色单体组成，两单体之间由着丝粒连接，着丝粒将染色体划分为长臂（Yq）和短臂（Yp）。细胞遗传学研究将人类Y染色体分为3个不同的功能区。①拟常染色体区：位于长、短臂的末端，与X染色体的末端属同源区。位于该区的基因，以常染色体基因的方式进行遗传，在男性减数分裂时与X染色体发生交换重组。②常染色质区：由着丝粒、拟常染色体区之外的短臂以及长臂的旁中央区组成。有无数高度重复序列，包括性别决定基因(SRY)和控制精子发生的基因如AZF等。③异染色质区：位于长臂的末端，介于拟常染色体区与常染色质区之间，可被荧光染料染色后发出荧光。
   
　　采用染色体显带技术对Y染色体进行区带划分，短臂有1区1带，长臂有1区2带，分别表示为Yp11、Yq11、Yq12，还可以细分为亚带和亚亚带如Yp11.32、Yq11.23等。其中性别决定基因位于Yp11.3区域，精子发生基因位于Yq11区域。

    还有学者将Y染色体从短臂至长臂人为地分成7个区间，其中短臂分为4个区间，长臂分为3个区间[2]。性别决定基因位于第1区间，精子发生基因位于第5～6区间。VOGET等[3]将Yq11区域划分为25个亚区，即D1～D25，精子发生基因位于无重叠的D3～D6、D13～D16和D20～D22亚区。

　　2  AZF微缺失的分类和机制

    1976年,TIEPOLO等[4]首先发现6例无精子病人存在显微镜下可见的Y染色体长臂远端部分缺失，这些病人其他方面均表现正常，推测Y染色体长臂远端存在控制精子发生的基因。由于这些基因的缺失是在无精子病人体内发现的，因此被称为AZF。VOGET等[5]根据AZF微缺失的发生部位，进一步将Y染色体长臂上控制精子发生的区域分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区。
   
　　AZFa位于Y染色体长臂的第5区间的D3～D6亚区，长度为1～3 Mbp，包含USP9Y、DBY、UTY等基因[6]。USP9Y是最早发现的AZFa的候选基因，其编码蛋白是泛素水解酶，作用在生殖细胞的发育中。

    AZFb位于Y染色体长臂第5～6区间的近侧端D13～D16亚区，长度为1～3 Mbp，包含RBMY、CDY、XKRY、SMY、eIF1等基因[7]。RBMY又名YRRM，是AZFb的最佳候选基因，编码一个RNA结合蛋白，特异表达在精原细胞和精母细胞。

    AZFc位于Y染色体长臂的邻近异染色质区的D20～D22亚区，长度为1.5 Mbp，包含DAZ、PRY、BPY2、TTY2等基因。DAZ为多拷贝基因，又称DAZ家族，是AZFc的最佳候选基因[8]，编码一个RNA结合蛋白，特异表达在精原细胞和减数分裂早期的生精细胞。
   
　　引起AZF微缺失的原因是DNA的顺向重复序列之间发生了同源重组，从而造成长度不等的基因片段丢失[9～11]。个体发生AZF微缺失主要有下列两种模式：①遗传性：微缺失的亲代→微缺失的精子→微缺失的子代；②再发性：正常的亲代→微缺失的精子、受精卵或早期胚胎→微缺失子代。
   
　　与X染色体和其他所有的常染色体相比，Y染色体更易发生微缺失，这是因为：①Y染色体不能像常染色体一样进行DNA修复；②在精子发生过程中细胞分裂速度快，与卵子发生过程相比具有更多突变机会；③Y染色体基因都是单倍体，一个基因缺失就能发生效应[12]；④Y染色体暴露于致突变因素的时间是X染色体或常染色体的2倍，在同样的不利环境中更易发生微缺失。

　　3  AZF的遗传与表型

    AZF基因在睾丸组织内特异性表达，AZFa、AZFb、AZFc分别主导精子形成过程中的不同阶段。在原发性无精子症或少精子症病人中，可以是单纯的AZFa、AZFb、AZFc区的基因缺失，也可以是两个以上AZF区域的基因同时缺失，另有少部分人（5%）基因的缺失发生在AZF以外的区域[1]。

　　3.1  AZFa缺失

    较为罕见，大约占1%～5%。可导致青春期精子发生阻滞，表现为单纯的唯支持细胞综合征（SCOS），睾丸组织检查示生精上皮细胞缺乏，无精原细胞出现。临床表现为小睾丸症，75%为无精子症，25%为严重少精子症。

　　3.2  AZFb缺失

    缺失率在16%左右。可导致青春期减数分裂前或减数分裂期间精子发生阻滞，表现为减数分裂前的生精细胞正常，而减数分裂后的生精细胞缺乏，病人的睾丸活检可见精原细胞和初级精母细胞，但没有精子生成。AZFb全部缺失时，临床表现为无精子症；部分缺失时，可表现为无精子症或严重的少精子症。

　　3.3  AZFc缺失

    是男性不育症病人中最常见的Y染色体微缺失，发生率为60%。睾丸组织学表现呈多样化，可有精原细胞并见有限的精子生成，也可以见到精子发生停滞于不同阶段的生精上皮细胞。病人出现无精子症和少精子症的不同临床表现。有的病人表现为精子计数正常，但多伴有精子形态异常。有少数病例虽然有了子代，而子代本身同样是AZFc位点缺失者，也已经证实其为无精子症者。由此看来，AZFc缺失者可以有不同的临床表现[13]。

　　3.4  两个以上的AZF区同时缺失

    发生率为14%。可以是AZFa+c、AZFb+c或AZFa+b+c的缺失，其中AZFb+c的缺失最为频繁，临床上表现为更加严重的精子生成障碍。

　　4  AZF微缺失的检测

    AZF微缺失在光学显微镜下难以分辨，提取外周血基因组的DNA，采用多重PCR技术，对选定的Y染色体序列标签位点(STSs)设计多对引物进行扩增，则较容易判断检出AZF区域的微缺失，这是当今检测男性生精障碍的一项重要的分子生物学技术。
   
　　Y染色体上有许多的序列标签位点，AZF的STSs图谱至今已更新过数次。STSs缺失在不同的地区、不同的种族间存在着差异。每个实验室选用的STSs不同，AZF缺失的检出率有很大的差异。比较有代表性的STSs在AZFa区主要是SY84、SY86，在AZFb区主要是SY127、SY134，在AZFc区主要是SY254、SY255等。欧洲分子生物学实验室已经制定了统一的标准，选定6个STSs作为欧洲Y染色体AZF微缺失筛查的位点[14]。没有资料支持选择的STSs越多，AZF微缺失的发生率就越高，反而增加实验室的工作量，影响检测效果。但是选择的STSs位点越多，尤其是包括了特异于AZF区域的位点及其邻近和远端的位点，AZF诊断的特异性和敏感性可能会明显提高。
   
　　AZF检测的准确性一直是学者关注的重点，应注意操作的每一个步骤，要设置适当的对照。用蒸馏水作空白对照，以检测试剂是否被污染。用正常生育的男性与女性做阳性或阴性对照，以排除假阳性的可能。用性别决定基因（SRY）和XY染色体共有的锌脂蛋白基因（ZFX/ZFY）作为内对照。在提取DNA时要提高纯度，避免假阴性。选择合适的引物序列、提高扩增产物的分子质量的差值，可以改善AZF的检测效果。对于可疑的AZF缺失的病人，应重复检测2～3次。

　　5  AZF微缺失检测的临床意义

    引起男性不育的原因很多，由精索静脉曲张、隐睾、生殖系统感染、内分泌紊乱、免疫反应异常等原因造成的男性不育可以通过手术治疗或药物治疗的方式解决，由遗传缺陷引起的精子发生障碍的病人，药物治疗没有任何效果，而这部分病人在男性不育中占有很大比例。有资料表明，AZF微缺失在精索静脉曲张、隐睾等病人中的检出率明显升高，如果不明确此类不育人群是否合并有遗传因素，手术和药物治疗的效果是很有限的[6]。因此，检测Y染色体AZF微缺失，明确精子生成障碍的真正原因，可以避免不必要的药物或手术治疗。
   
　　目前，对无精子症和严重少精子症病人生育的有效治疗方法是卵细胞浆内单精子注射术（ICSI）。精子的来源可以是精液中排出的少量精子，也可以是睾丸细针穿刺术（TESA）或经皮附睾穿刺抽吸取精术(PESA)获得的精子[15]。由于失去了自然选择的屏障作用，受孕的精子可能是带有AZF微缺失的精子，这样就人为地把基因缺陷遗传给男性子代。带有Y染色体微缺失的精子，其胚胎的种植率与正常精子相比是否有差别，目前还存在着一些相互矛盾的结果，但胚胎植入前遗传学诊断技术（PGD）可以筛查AZF微缺失，通过选择女胚植入而终止缺陷基因传递的途径。

    睾丸穿刺取精具有很大的侵袭性，而且大约50%的非梗阻性无精子症的病人睾丸穿刺不能获得精子。为了减少病人穿刺取精时的痛苦、降低配偶术前所要经历的卵泡促排和穿刺取卵的负担，有必要提前对睾丸取精的可行性进行有意义的评估。尽管AZF微缺失的遗传与表型之间的关系没有最终确定，但已有很多资料表明，AZFa或AZFb完全缺失的病人，睾丸穿刺获得精子的可能性几乎为零，没有必要行睾丸穿刺[5]。只有一部分AZFc缺失的无精子症病人，睾丸穿刺可能获得成熟的精子。
   
　　AZF微缺失的种类与个体精液从少精子至严重少精子、直至无精子的进展有关。有学者对91例Y染色体微缺失者的男性近亲（父或兄弟）进行筛查，5例AZFc微缺失的父亲将基因缺陷传给儿子，这表明Y染色体微缺失者的精子生成可随时间而改变[16]。对于少精子症的病人，预先明确其AZF缺失的基因型，随时了解其精子质量特别是精子数量随时间变化的情况，提前冷冻保存精子以备将来之需，不失为一种明智的选择。

【参考文献】
  　　[1]FORESTA C. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis[J]. Endocr Rev, 2001,22:22622391.

　　[2]LAHN B T, PAGE D C. Functional coherence of the human Y chromosome[J]. Science, 1997,278(24):675679.

　　[3]VOGET P H. Human chromosome deletion in Yq11, AZF candidate genes and male infertility:history and update[J]. Mol Hum Reprod, 1998,4:739744.

　　[4]TIEPOLO L, ZUFFARDI O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J]. Hum Genet, 1976,34(2):119124.

　　[5]VOGET P H, EDDMAN A, KIRSH S, et al. Human Y chromosome azoospermia factors mapped to different subregions in Yq11[J]. Hum Mol Genet, 1996,5(7):933936.

　　[6]KUNEJ T, ZORN B, PETERLIN B. Y chromosome microdeletions in infertile men with cryptorchidesm[J]. Fertil Steril, 2003,79:15591565.

　　[7]FERLIN A, MORO E. The human Y chromosome's azoospermia factor b (AZFb) region:sequence,structure,and deletion analysis in infertile men[J]. J Med Genet, 2003,40(1):1824.

　　[8]FERLIN A, BETTELLA A, SPOLAORE D, et al. Analysis of the DAZ gene family in cryptorchidism and idiopathic male infertility[J]. Fertil Steril, 2004,81(4):10131018.

　　[9]SUN C, SKALETSKYR H, ROZEN S, et al. Deletion of a zoospermia factor a (AZFa) region of human Y chromosome caused by recombination between HERV15 proviruses[J]. Hum Mol Genet, 2000,9:22912296.

　　[10]REPPING S, SKALETSDY H, LANGE J, et al. Recombination between palindromes P5 and P1 on the human Y chromosome causes massivedeletions and spermatogenic failure[J]. Am J Hum Genet, 2002,71:906922.

　　[11]KURODAKAWAGUCHI T, SKALETSKY H. The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes,and uniform recurrentdeletions in infertile men[J]. Nat Genet, 2001,29:279286.

　　[12]HIROSHI K, SHINJI K, YUKO N. Screening for deletions in interval D16-22 of the Y chromosome in azoospermic and oligozoospermic Japanese men[J]. Hum Genet, 2001,46(3):110114.

　　[13]MC ELREAVEY K, KRAUSZ C, PATRAT C, et al. Male infertility and microdeletions of the Y chromosome[J]. Gynecol Obstet Fertl, 2002,30(5):405412.

　　[14]SIMONI M, BAKKER E, KRAUSZ C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y chromosomal microdeletions.State of the art 2004[J]. Int J Androl, 2004,27(4):240249.

　　[15]刘海宁,汤秀明,李强,等. 卵母细胞浆内单精子显微注射治疗男性不育的效果[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(1):3132.

　　[16]涂向东,谢飞,张宝珍,等. 男性生精障碍的细胞遗传学和分子遗传学检测[J]. 中国男科学杂志， 2006,20(1):2831.

作者单位：烟台山医院生殖中心，山东 烟台 264001