HBV相关性肝细胞癌病人Fas检测及意义

【摘要】  目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌病人外周血淋巴细胞表面所表达的Fas/FasL与血清sFas/sFasL的变化规律及意义。方法 对47例HBV相关性肝细胞癌病人、50例无症状HBV携带者及57例健康志愿者(健康对照组)外周血淋巴细胞的凋亡率、膜性Fas/FasL表达和血清sFas/sFasL含量进行检测。结果与无症状HBV携带组及健康对照组比较，HBV相关性肝细胞癌组外周血淋巴细胞早期凋亡率增高，膜性Fas表达率升高，而FasL表达率则显著降低，差异有显著性（F=6.13～15.34，q=4.02～32.10，P<0.01)；血清sFas含量升高，sFasL含量降低，差异有显著性（F=7.30、4.20，q=6.19～42.35，P<0.01）。无症状HBV携带组与健康对照组各指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HBV相关性肝细胞癌病人体内依赖Fas介导的细胞毒性T淋巴细胞失去杀伤性识别作用，对淋巴细胞的清除能力下降，导致肿瘤细胞获得异常生存能力。

【关键词】  肝肿瘤 肝炎病毒 乙型 Fas 细胞凋亡

　　ASSAY OF FAS IN PATIENTS WITH HBVRELATED HEPATIC CELLULAR CANCER

　　LIU FENGHAI, YUAN JIANGSHUI, YU QINGHUA

　　(Clinical Laboratory, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 200011, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the relationship between Fas/FasL expressed on lymphocytes and in serum (sFas/sFasL) in patients with HBVrelated hepatic cellular carcinoma (HCC).MethodsThe apoptotic rates of lymphocytes and the expressions of Fas/FasL on lymphocytes and in serum (sFas/sFasL) were detected in 47 HCC patients,50 asymptomatic HBV carriers and 57 healthy controls.ResultsCompared with the HBV carries and controls, the apoptotic rate and the expression of Fas of HCC lymphocytes were increased (F=6.13,q=4.02-32.10,P<0.01;F=9.75,q=8.02-29.75,P<0.01), the expression of FasL was significantly decreased (F=15.34,q=14.02-24.16,P<0.01). Data of sFas were significantly increased in HCC (F=7.30,q=15.4-36.1,P<0.01) while sFasL  deccreased (F=4.20,q=6.19-42.35,P<0.01). The differences in data of sFas and sFasL between the HBV and controls were not significant (P>0.05).ConclusionThe effect of CTL in patients with HBVrelated HCC is decreased, therefore, the tumor gains powerful survival ability.
    
　　［KEY WORDS］Liver neoplasms; Hepatitis virus, type B; Fas; Apoptosis
     
　　乙型肝炎病毒(HBV)感染人体后，人体以细胞凋亡方式清除感染细胞，Fas是介导细胞凋亡的细胞表面分子，而肝癌的发生机制之一是癌变细胞逃避免疫活性细胞介导的杀伤作用。目前，有关HBV和sFas/sFasL关系的报道很多，但说法不一[1]。本文通过检测HBV相关性肝细胞癌病人外周血淋巴细胞的凋亡、细胞膜表面Fas/FasL及血清sFas/sFasL水平的变化，探讨Fas/FasL在HBV相关性肝细胞癌发病机制中的作用，为预防和治疗肝细胞癌提供新的思路。

　　1   资料和方法

　　1.1   一般资料
    
　　2005～2007年，选择青岛市市立医院住院治疗的HBV相关性肝细胞癌病人（C组）47例，男32例，女15例；年龄27～78岁，平均(38.0±16.5) 岁。诊断均符合2001年9月第八次全国肝癌学术会议制定的原发性肝癌的临床诊断与分期标准[1]。门诊无症状HBV携带者（B组）50例，男38例，女12例；年龄20～69岁，平均(34.0±13.9) 岁；诊断均符合2000年9月第七次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案诊断标准[2]。选择同期57例健康志愿者作为健康对照组（A组），其中男37例，女20例；年龄18～58岁，平均(27.0±14.2) 岁。

　　1.2   检测指标及方法
    
　　无菌取受检者（病人治疗前）血15 mL，分离淋巴细胞及血清，－80 ℃保存备用。采用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞的凋亡率(计数104个细胞中凋亡细胞所占的百分比)和细胞表面表达的Fas/FasL，双抗体夹心法检测血清中的sFas/sFasL水平。淋巴细胞分层液购自武汉博士德生物技术有限公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司，酶标检测仪购自美国BioRad公司，FAC Sort流式细胞仪由美国BD公司提供。

　　1.3   统计学处理
    
　　采用SPSS 8.8和PPMS 1.5[3]统计软件进行数据处理，结果用±s表示，3组数据间比较用方差分析，方差不齐则用非参数检验。

　　2   结果

　　2.1   各组外周血淋巴细胞的凋亡率及细胞表面Fas/FasL表达率比较
    
　　与无症状HBV携带组及健康对照组比较，HBV相关性肝细胞癌组外周血淋巴细胞凋亡率明显增高，差异有显著性（F=6.13，q=4.02～32.10，P<0.01）；Fas的表达率也明显升高（F=9.75，q=8.02～29.75，P<0.01），而FasL的表达率则显著降低，差异有统计学意义（F=15.34，q=14.02～24.16，P<0.01）。无症状HBV携带组与健康对照组以上各指标比较，差异无显著意义（P>0.05）。见表1。

　　2.2   各组血清sFas/ sFasL含量比较
    
　　与无症状HBV携带组及健康对照组比较，HBV相关性肝细胞癌组血清sFas含量明显升高，sFasL含量明显降低，差异有极显著性（F=4.20、7.30，q=6.19～42.35，P<0.01）。无症状HBV携带组与健康对照组血清sFas和sFasL含量比较，差异无显著性（P>0.05）。见表2。

　　表1   各组外周血淋巴细胞凋亡率及Fas、FasL表达率比较（略）

　　与A组及B组比较，F=6.13～15.34，*q=4.02～32.10，P<0.01
    
　　表2   不同组别血清sFas及sFasL含量比较（略） 

　　与A组及B组比较，F=4.20、7.30，*q=6.19～42.35，P<0.01

　　3   讨论
   
　　HBV感染引起的慢性肝炎是严重危害人类健康的常见顽症之一，在慢性HBV感染基础上，可发展为重型肝炎、肝硬化，甚至肝细胞癌。有研究显示，HBV感染机体后，免疫活性细胞包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤（NK）细胞等通过Fas系统活化介导细胞毒作用，以凋亡方式清除感染细胞，通过免疫反应等引起肝细胞凋亡或坏死[4]。
    
　　机体通过表达Fas 引起FasL 阳性的CTL细胞毒作用,对于杀灭肿瘤细胞有重要意义,肿瘤的发生很可能与Fas 表达或功能异常有关[5]。FasL表达阳性CTL对靶细胞特别是Fas表达阳性肿瘤细胞有直接杀伤作用，或者通过FasL表达阳性T淋巴细胞分泌sFasL杀伤肿瘤细胞。OKA等[6]通过免疫组化分析显示，肝肿瘤组织有明显的淋巴细胞浸润，这些细胞主要是CD8+和HLADR+细胞，同时显示Fas表达阳性肿瘤细胞凋亡系淋巴细胞表达FasL或分泌sFasL攻击肿瘤细胞所致。
    
　　本文结果显示，与健康人和无症状性HBV携带者比较，HBV相关性肝细胞癌病人外周血淋巴细胞的凋亡率明显升高， Fas表达率也显著增高，这与文献报道结果相吻合[7]。本文结果还显示，与健康人和无症状性HBV携带者比较，HBV相关性肝细胞癌病人外周血淋巴细胞FasL表达明显降低，差异有统计学意义。其原因可能是肝癌细胞异常高表达FasL的同时，下调或抑制癌细胞膜表面Fas表达，并使淋巴细胞膜性FasL的表达受到抑制，导致体内依赖Fas介导的CTL失去杀伤性识别作用，使肿瘤细胞获得异常生存能力。
    
　　本文结果显示，HBV相关性肝细胞癌病人血清sFas含量明显高于健康对照组，而sFasL含量明显低于健康对照组。我们认为，肝癌病人血清中异常升高的sFas一方面主要来源于活化的T、B淋巴细胞表面膜性Fas的高表达，另一方面来源于肿瘤细胞脱落或丢失。正常情况下，sFas的产生对免疫功能有调节作用，防止免疫反应过弱，但在感染、损伤、SLE、肿瘤等病理状态下sFas产生增加，对免疫功能有抑制作用，是肿瘤细胞逃避免疫的机制之一[8]，因此认为sFas对促进肿瘤发生和发展有重要作用。另外，HBV相关性肝细胞癌病人血清sFas含量增高，sFasL含量降低，降低的sFasL与sFas结合减少，则sFas进一步增多，sFas与免疫活性细胞膜上的FasL大量结合，封闭其免疫活性，降低其致凋亡能力，不能清除肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不断繁殖、转移[8]。本研究还显示，HBV相关性肝细胞癌病人外周血中淋巴细胞凋亡率明显高于健康人，进一步证实了这一观点。
    
　　对于肝细胞癌病人，我们认为一方面可通过提高肝癌细胞膜上基质金属蛋白酶活性，促进肝细胞膜性FasL的切割，形成sFasL，也可阻断sFas对免疫活性细胞功能的下调作用，恢复免疫活性细胞的功能；还可利用加入外源性sFasL的途径，提高免疫活性细胞对肿瘤细胞的杀伤识别和清除能力，提高对化疗、放疗的敏感性，达到抑制肿瘤发展及增强疗效的目的。

【参考文献】
  　　[1]杨秉辉,夏景林. 原发性肝癌的临床诊断与分期标准[J]. 肿瘤防治研究, 2002,29(1):83.

　　[2]中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案[J]. 中华传染病杂志, 2001,19(1):5662.

　　[3]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[4]黎明,王曾礼. 细胞凋亡的基础与临床[M]. 北京:人民卫生出版社, 2000:401403.

　　[5]张娜娜,刘班,刘成玉.可溶性Fas 与恶性肿瘤[J]. 齐鲁医学杂志, 2006,21(1):9294.

　　[6]OKAZAK M, HINO K, FUJII K, et al. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO1) ligandexpressing tumor cells.A mechanism of immune evasion[J]. Nature Med, 1996,2:13611366.

　　[7]HIRAMATSU N, HAYASHI N, KATAYANA K, et al. Proteintyrosine phosphatase 1B deficiency protects against fasinduced hepatic failure[J]. Hepatology, 1994,19(6):13541359.

　　[8]葛益谋,杨志革. 肝细胞癌病人血清可溶性Fas、FasL变化及其监测价值[J]. 广西医科大学学报, 2007,24(2):274275.

作者单位：青岛市市立医院检验科，山东 青岛 266011